体外共培养的乳鼠心肌细胞和大鼠骨骼肌成肌细胞中Connexin43的表达

摘要

成熟的心肌细胞属于终末分化细胞，损伤坏死后不能进入细胞周期进行再生，因此心肌梗死（MI）后，虽然通过治疗能改善心肌缺血症状，却不能逆转已经坏死的心肌，最终发生充血性心力衰竭，并致死。因此人们一直在积极寻找一种能替代坏死心肌的细胞，以期能更好的治愈心血管疾病。近年来随着干细胞的深入研究，干细胞移植为心肌梗死治疗带来了新的希望。在有关细胞移植的众多研究中.骨骼肌成肌细胞由于具有能耐受缺血；增殖能力强，体外培养能获得大量可供移植的细胞；可自体移植，避免了免疫排斥反应；植入体内后不会无限制增殖或形成肿瘤这些优势，成为人们关注的焦点。要成功修复受损心肌，移植细胞必须与周围宿主心肌细胞达到解剖和功能上的整合。成肌细胞单独培养后，若延迟分瓶或降低血清的浓度，会相互融合，分化形成多核的肌管，Cx43蛋白表达明显下调。Cx43是心肌缝隙连接（gap junction）中的主要蛋白。缝隙连接又称通讯连接，是由连接相邻两个细胞之间的连接蛋白排列而成的一种特殊膜结构。相邻细胞间通过缝隙连接所介导的细胞间通讯（gap junction intercellular communication GJIC）参与细胞间物质交换的代谢偶联和电信号传递的电偶联，对细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖及分化等生理过程起着重要的调控作用。心肌细胞之间的电信号传导有赖于缝隙连接蛋白结构和功能的完整性。目前。不少研究结果表明：成肌细胞与心肌细胞共培养后，在两种细胞接触的细胞膜上，或成肌细胞移植到心梗区域后与周围宿主心肌细胞之间有缝隙连接形成，表达Cx43；能检测到瞬时钙离子流；有类似心肌的钠离子电压门控通道形成。这些都暗示：移植的细胞有可能与周围宿主心肌细胞之间形成良好的缝隙连接，实现同步收缩。也有很多学者持反对意见：认为不能形成良好的电偶联，会导致严重心律失常。目前，关于这一方面的研究存在不同的结果，我们的实验是将大鼠骨骼肌成肌细胞（以下简称L6cells）以及转染外源性Connexin43（Cx43）基因的L6cells（以下简称L6-Cx43cells）和乳鼠心肌细胞在体外共培养，通过免疫荧光细胞化学、透射电镜、Western Blotting技术观察两种细胞问Cx43蛋白的表达情况，探讨两种细胞间能否形成良好的电偶联。
　　 本实验分三部分。
　　 一 L6cells的生长分化特性及Connexin43的表达
　　 本实验采用倒置显微镜和HE染色观察L6cells生长分化情况，应用Western Blotting技术检测随着肌管的形成Cx43蛋白的表达水平。
　　 结果显示，L6cells正常生长为梭形，48小时传代能保持其理想未分化状态，分化培养后第三天有多核肌管形成，并随时间延长增多。Western Blotting结果显示，与对照组相比各分化组Cx43蛋白表达均降低，并且随时间延长Cx43蛋白表达显著降低。（各时间点两两比较，均P<0.05）。
　　 二乳鼠心肌细胞的分离培养、鉴定
　　 取出生1-3d的乳鼠，75％酒精消毒，开胸取心室肌剪成1mm3的小块，用胰酶和EDTA消化后，通过差速贴壁和加入0.1mmoL/L Brdu来纯化心肌细胞。按所需数量接种在培养瓶中，在37℃，5％CO2条件下培养于含10％胎牛血清、青霉素100 ug/mL、链霉素100μ/mL组成的完全培养基中。48小时后换液去除Brdu，以后隔天换液。72小时，倒置显微镜观察：心肌细胞呈梭形、多角形、星形等不规则形态，伸出伪足相互接触，交织成网，搏动出现成片性同步化，频率多为60-120次/分。
　　 用Sarcomeric Actin抗体进行免疫细胞化学染色，结果显示：心肌细胞呈不规则，多突起形状。胞浆中出现棕黄色颗粒状物质。证明是心肌细胞。
　　 三体外共培养的乳鼠心肌细胞和大鼠骨骼肌成肌细胞中Connexin43的表达
　　 本实验探讨了L6cells DAPI标记的浓度和时间；通过免疫细胞化学、Western Blotting技术、透射电镜检测共培养的两种细胞中Cx43蛋白表达及缝隙连接形成情况。
　　 DAPI标记浓度选取15μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，各自标记4h，8h，12h，传代后观察，综合细胞生长状态和荧光衰减情况，选取合适的标记浓度和时间。结果显示：以25μg/mL的浓度标记8h，效果最好，能满足实验需要。
　　 免疫荧光细胞化学结果：L6cells核标记为蓝色，共培养6天后，心肌胞质内Sarcomeric Actin表达阳性，L6cells Cx43的表达弱阳性，Sarcomeric Actin表达弱阳性，两种细胞接触的细胞膜上有Cx43表达。
　　 Western Blotting结果显示：两种细胞共培养组分别与心肌组、L6cells组、L6-Cx43cells组、L6cells心肌条件液组相比，Cx43表达明显增多；L6-Cx43cells共培养组比L6cells共培养组Cx43表达明显增多（以上各组相比均P<0.05，有显著差异）。L6cells组、L6-Cx43cells组、L6cells心肌条件液组Cx43表达均随时间（取3、6、9天）延长降低。
　　 透射电镜观察：心肌细胞中可看到平行排列的肌丝，闰盘结构，与周围L6cells有类似中间连接形成。
　　 结论:
　　 1 L6cells在正常生长条件下呈梭形，为保持其理想未分化状态应及时传代。分化培养后，三天即出现融合的肌管，随时间延长，多核长肌管的形成明显增多，Cx43表达也随之降低。
　　 2免疫荧光细胞化学显示，L6cells与心肌细胞以及L6-Cx43cells与心肌细胞分别共培养后两种细胞接触的细胞膜上均有Cx43的表达。
　　 3 Western Blotting结果进一步证实，共培养后L6cells中Cx43的表达明显增多，L6-Cx43cells中Cx43增多更明显，但是单纯的心肌条件液环境对Cx43的表达没有明显影响，说明共培养能促进L6cells Cx43的表达，转染外源性Cx43基因后，能提高Cx43的表达水平，且两种细胞直接接触是必须的。
　　 4透射电镜下，发现两种细胞间有类似中间连接形成，未找到缝隙连接，可能与切片的部位不同有关。

目录

文摘

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前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 骨骼肌成肌细胞移植治疗缺血性心脏病的研究进展和临床前景

致谢

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