缺氧大鼠乳鼠心肌细胞中Sema3a调节connexin43磷酸化水平的相关性研究

摘要

目的： Semaphorin-3A(Sema3a)是一种神经化学抑制物，既可以调节交感神经分布，又在分子信号转导通路中起重大作用。本研究拟通过慢病毒转染大鼠乳鼠心肌细胞，改变乳鼠心肌细胞中Sema3a 蛋白的表达量，研究在缺氧条件下心肌细胞中Sema3a 的蛋白改变对在心肌细胞间通讯中起重要作用的连接蛋白43（connexin 43）磷酸化水平的影响。
　　 方法：（1）体外培养大鼠乳鼠心肌细胞，随机分为6 组，每组12 个样本，取非缺氧组做对照，分别缺氧0.5h，2h，5h，12h，24h 后，提取总蛋白，用蛋白印记法（Western blot）检测Sema3a 蛋白水平，统计Sema3a 在不同缺氧时间点的变化。（2）体外培养大鼠乳鼠心肌细胞，随机分为5 组，每组12 个样本，取非缺氧组做对照，对心肌细胞分别缺氧0.5h，1h，2h，4h, Western blot 检测p-connexin43 (Ser 279/282)及Sema3a 蛋白变化，确定检测p-connexin 43 (Ser 279/282)及Sema3a 蛋白的最佳缺氧时间。（3）Sema3a 高表达及抑制慢病毒载体构建并转染大鼠乳鼠转染心肌细胞，转染4-5 天后对转染后心肌细胞进行缺氧，各随机分为缺氧组(C)，缺氧+空病毒组（G），缺氧+病毒组（V1,V2）3 组，每组6 个样本，然后对缺氧的心肌细胞进行蛋白提取，Western blot 检测Sema3a 蛋白水平变化，确定病毒转染效果，Western blot 检测细胞中p-connexin 43 (Ser 279/282)蛋白水平变化，确定Sema3a 改变对 p-connexin 43 (Ser 279/282)蛋白的影响。
　　 结果:（1）大鼠乳鼠心肌细胞缺氧0h，0.5h，2h，5h，12h，24h 后，Sema3a 在缺氧0h,0.5h，2h，5h 时无明显变化，缺氧12h 时与0h,0.5h，2h，5h 时蛋白水平相比急剧降低（12h vs. 0h:0.2043±0.0531 vs. 0.4508±0.2298 , P=0.015)，(12h vs.0.5h: 0.2043±0.0531 vs.0.4503±0.2015, P=0.015),（12h vs. 2h:0.2043±0.0531 vs.0.4540±0.2064 , P=0.013), （12h vs. 5h:0.2043±0.0531 vs. 0.4148±0.1967 ,P=0.035)，Sema3a 在缺氧12h 与24h 两组之间无明显差异（P＞0.05）。（2）大鼠乳鼠心肌细胞分别缺氧0h，0.5h，1h，2h，4h 后，1h 缺氧组p-connexin 43 (Ser279/282)蛋白变化最明显，相对于0h, 0.5h，2h，4h 急剧升高(1h vs. 0h:0.5277±0.0117 vs. 0.2878±0.0390 , P=0.000), (1h vs. 0.5h: 0.5277±0.0117 vs.0.3251±0.0165 , P=0.000), (1h vs. 2h: 0.5277±0.0117 vs. 0.3152±0.0182 , P=0.000),(1h vs. 4h: 0.5277±0.0117 vs. 0.2947±0.0317 , P=0.000),其余时间点两两比较变化均无统计学意义;Sema3a 在各时间点的蛋白水平无明显差异（P＞0.05）。（3）Sema3a 高表达慢病毒转染大鼠乳鼠心肌细胞，检测缺氧1 小时Sema3a 及p-connexin 43 (Ser 279/282)的蛋白水平，缺氧+空病毒组（G）与缺氧组(C)之间的Sema3a 及p-connexin 43 (Ser 279/282)蛋白水平没有明显差异（P＞0.05）；缺氧+Sema3a 高表达病毒组(V1)的Sema3a 蛋白水平明显高于其他两组(V1 vs. C:0.6861±0.0889 vs. 0.3708±0.0214, P=0.000)，（V1 vs. G: 0.6861±0.0889 vs.0.3722±0.0316，P=0.000）；V1 组的p-connexin 43 (Ser 279/282)蛋白水平明显低于其他两组(V1 vs. C: 0.1550±0.0341 vs. 0.3250±0.0378, P=0.004），(V1 vs. G:0.1550±0.0341 vs. 0.3400±0.0938, P=0.002)。Sema3a RNA 干扰慢病毒转染大鼠乳鼠心肌细胞，检测缺氧1 小时Sema3a 及p-connexin 43 (Ser 279/282)的蛋白水平，缺氧+空病毒组（G）与缺氧组（C）之间的Sema3a 及p-connexin 43 (Ser 279/282)蛋白水平没有明显差异（P＞0.05）；缺氧+Sema3a 抑制表达病毒组（V2）的Sema3a蛋白水平明显低于其他两组（V2 vs. C: 0.1684±0.0794 vs. 0.3846±0.1394,P=0.034），（V2 vs. G: 0.1684±0.0794 vs. 0.3768±0.1391, P=0.039）；V2 组的p-connexin 43 (Ser 279/282) 蛋白水平明显高于其他两组（V2 vs. C: 0.6670±0.0187 vs. 0.3550±0.0298, P=0.000），（V2 vs. G: 0.6670±0.0187 vs. 0.3498±0.0376, P=0.000）。
　　 结论：在缺氧条件下，Sema3a 蛋白水平与connexin 43 (Ser 279/282)磷酸化水平具有负相关性，提示Sema3a 在影响缝隙连接功能，诱发室性心律失常中有重大作用。

目录

前 言

第一部分 Sema3a 与p-connexin 43 (Ser 279/282)在不同缺氧时间点乳鼠心肌细胞中的蛋白变化

第二部分 Sema3a高表达慢病毒表达载体的构建及转染乳鼠心肌细胞后对于P-connexin 43 (Ser 279/282)蛋白水平的影响

第三部分 Sema3a抑制慢病毒表达载体的构建及转染乳鼠心肌细胞后对于P-connexin 43 (Ser 279/282)蛋白水平的影响

全文小结

文献综述

致 谢

发表论文

论文说明:缩略词表

声明