葶苈生脉方对心衰大鼠心肌细胞凋亡及相关调控基因的影响

摘要

目的：葶苈生脉方（由红参、生黄芪、丹参、麦冬、葶苈子、益母草、五味子、红花、赤芍等药物组成）具有益气温阳，活血利水的功效，经临床观察证明，对充血性心力衰竭具有较好的治疗效果，为了进一步探讨其作用机制，参照相关文献运用腹主动脉缩窄法复制了心力衰竭大鼠模型，同时施加药物干预，通过观察其对心衰大鼠血流动力学的影响，探讨其改善心功能方面的作用机制；通过观察其对心肌细胞凋亡及相关调控基因Bcl-2、Bax和caspase3蛋白表达的影响，探讨其抗心肌细胞凋亡的作用机制；并运用HE染色方法观察该方对心肌组织形态学的影响。
　　 方法：
　　 第一部分葶苈生脉方对心衰大鼠血流动力学与心肌组织形态学的影响
　　 选用Wistar大鼠60只，自由饮水进食，饲养于18℃～22℃明暗各12小时的清洁级动物实验室内，正常喂养一周后，随机分为5组，每组12只。具体分组情况如下：（1）假手术对照组（简称假手术组）；（2）模型对照组（简称模型组）；（3）葶苈生脉方高剂量组（简称高剂量组）；（4）葶苈生脉方低剂量组（简称低剂量组）；（5）阳性药（心宝丸）对照组（简称对照组）。参照相应文献运用腹主动脉缩窄法复制心衰大鼠模型，假手术组除不缩窄腹主动脉外，其他操作同手术组。造模4周后，正常组和模型组灌服蒸馏水，各治疗组灌服治疗药或对照药。各组1次/d灌胃，每次用药体积均按1ml/100g计算。实验12周末，于最后一次给药禁食12h后，麻醉状态下分离右颈总动脉及开胸分离升主动脉，0.3％肝素（2mg/kg）尾静脉注射，肝素化后右颈总动脉插管记录血压，心尖部插管记录左心室内压，用MS4000生物信号定量记录分析系统记录心率（HR）、左室收缩内压（LVSP）和左室内压最大变化速率（±dp/dtmax）。并留取心尖部少许心肌组织，4％多聚甲醛固定，HE染色，光镜下观察心肌组织形态学变化。
　　 第二部分葶苈生脉方对心衰大鼠心肌细胞凋亡相关调控基因的影响
　　 实验动物分组、用药情况同前。实验12周末，于最后一次给药禁食12h后，麻醉状态下，剖取动物心脏，于心尖部取少许心肌组织，滤纸吸净血液，70％乙醇固定后，剪碎至1mm3大小，然后置于100目铜网上轻搓，边搓边以生理盐水冲洗，直至将组织搓完。收集细胞悬液，离心2分钟，弃去上清，去除细胞碎片，运用流式细胞仪检测心衰大鼠心肌细胞增殖与凋亡及相关调控基因Bcl-2、Bax和Caspase3蛋白表达的情况。
　　 所有数据均采用SPSS13.0软件进行统计分析。
　　 结果：
　　 第一部分葶苈生脉方对心衰大鼠血流动力学与心肌组织形态学的影响
　　 1、一般情况观察
　　 60只大鼠在造模过程中，死亡5只，在治疗过程中，继续死亡7只，故实际观察到的大鼠为48只。实验期间，假手术组大鼠生长良好，饮食正常，反应灵敏。模型组大鼠逐渐出现蜷卧扎堆，活动减少，精神萎靡，皮毛凌乱，色枯无泽等现象。至实验后期，模型组大鼠体重增长缓慢甚至逐渐降低，少数大鼠出现轻度腹水。高、低剂量组和对照组的大鼠一般情况较好。
　　 2、各组大鼠血流动力学的变化
　　 与假手术组相比，模型组大鼠LNEDP和-dp/dtmax显著升高，心率显著增加，LVSP、+dp/dtmax、MAP显著下降P<0.05或.P<0.01），心肌收缩与舒张功能明显障碍。经用药干预后，各治疗组均能显著降低LVEDP、-dp/dtmax及其心率，显著升高LVSP、+dp/dtmax、MAP（P<0.05或P<0.01），其中高剂量组优于低剂量组和对照组（P<0.05或P<0.01），低剂量组与对照组之间无明显差异（P>0.05）。
　　 3、各组大鼠心肌组织形态学的变化
　　 假手术组大鼠心肌细胞纹理清晰，走形正常，胞浆着色均匀，间质细胞无增生，间质无扩张、充血。模型组大鼠心肌纤维着色不均，部分心肌呈典型颗粒样变性，表现为胞浆浅染，浆内可见充满细小粉红染颗粒，纹理消失，间质轻度水肿，灶性间质细胞增生，并可见部分灶性心肌纤维走形中断，心肌细胞核萎缩，染色变深。高剂量组、低剂量组、心宝丸组的大鼠心肌损害均较模型组减轻，心肌纤维有轻度颗粒样变性，间质无明显充血。
　　 第二部分葶苈生脉方对心衰大鼠心肌细胞凋亡相关调控基因的影响
　　 1、各组大鼠心肌细胞凋亡率的变化
　　 流式细胞仪检测结果显示：模型组大鼠心肌细胞凋亡率比正常组显著升高（P<0.01）；经药物干预后，各用药组均比模型组明显下降（P<0.01）。其中，高剂量组低于低剂量组（P<0.05），而高剂量组与对照组比较无明显差异（P>0.05）。
　　 2、各组大鼠心肌细胞增殖周期的变化
　　 模型组大鼠G0/G1期细胞百分率较正常组升高（P<0.01）；而S期和G2/M期细胞百分率均较正常组降低（P<0.01）。经用药干预后，高、低剂量组及对照组G0/G1期细胞百分率明显低于模型组（P<0.01）；而S期和G2/M期细胞百分率显著高于模型组，（P<0.05或P<0.01）。而高、低剂量组与对照组之间各项指标变化无明显差异（P>0.05）。
　　 模型组细胞增殖指数较正常组降低（P<0.01）；经用药干预后，葶苈生脉方高、低剂量组及对照组的细胞增殖指数较模型组明显增高（P<0.01），表明各治疗组细胞增殖速度高于模型组。而高、低剂量组与对照组之间无明显差异（P>0.05）。
　　 3、各组大鼠心肌细胞凋亡调控蛋白Bcl-2、Bax和caspase3表达的变化
　　 与正常组比较，模型组大鼠肝细胞凋亡率明显增高（P<0.01），Bcl-2蛋白表达FI值明显降低（P<0.01），而Bax和caspase3蛋白表达FI值及Bax/Bcl-2比值则明显增加（P<0.01）。经用药干预后，高、低剂量组及对照组心肌细胞凋亡率明显下降（P<0.01），Bcl-2蛋白表达FI值明显增加（P<0.01），而Bax、caspase3蛋白表达FI值和Bax/Bcl-2比值则明显降低（P<0.05或P<0.01）。
　　 各用药组中，高、低剂量组与对照组的Bcl-2蛋白表达FI值经统计学处理未见显著性差异（P>0.05）；低剂量组Bax蛋白表达FI值以及低剂量组和对照组的Bax/Bcl-2比值则均高于高剂量组（P<0.05）：高、低剂量组的caspase3蛋白表达FI值均低于对照组，而高、低剂量组之间经统计学处理未见显著性差异（P>0.05）。
　　 结论：
　　 1、葶苈生脉方可明显改善心衰大鼠心肌组织学的病变程度，表现为用药后心肌细胞颗粒样变性减轻或消失，心肌纤维排列整齐，间质无明显扩张充血。说明本方对心肌细胞有保护作用。
　　 2、葶苈生脉方能明显升高心衰大鼠的MAP和LVSP，增加+dp/dtmax，降低LVEDP，具有增强心肌收缩力，改善心肌舒张功能的作用。
　　 3、葶苈生脉方能通过促进Bcl-2蛋白表达，抑制Bax和Caspase3蛋白表达，降低心肌细胞凋亡率，以保护心肌细胞，从而达到抗心力衰竭作用，此可作为葶苈生脉方治疗心力衰竭的作用机制之一。

目录

文摘

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论文说明：英文缩写

声明

引言

第一部分 葶苈生脉方对心衰大鼠血流动力学及心肌组织形态学的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 葶苈生脉方对心衰大鼠心肌细胞凋亡及相关调控基因的影响

前言

材料与方法

结果

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 充血性心力衰竭的中医药临床研究进展

致谢

个人简历