年龄相关性冠心病病人骨髓间充质干细胞体外培养及低能量激光干预对细胞增殖能力影响的研究

摘要

目的：骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有易于在体外扩增、多种分化潜能、低免疫性等特性，临床应用前景广泛，但其需在体外应用含胎牛血清等培养基进行培养，可能导致细胞生物学特性发生改变以及其它潜在风险，从而限制了临床批文的下发，故临床试验细胞来源多限于骨髓单个核细胞（morionuclear bone marrow cells，BMC），循环血前体细胞（circulating blood-derived progenitor cells，CPC）及骨骼肌原细胞（skeletal myoblasts），有关冠心病病人骨髓MSCs基础研究鲜见报道。本研究旨在探索适于冠心病病人骨髓MSCs骨髓提取、细胞分离、培养的方法，并比较中老年冠心病病人骨髓MSCs增殖能力差异；探索冠心病病人骨髓MSCs冻存复苏可能性及对细胞生长特性的影响；应用低能量激光对细胞培养过程进行干预，了解其对细胞增殖能力的影响。
　　 方法：冠心病，三支血管病变，行CABG手术病人，中年组23例（年龄45～59岁，平均53±5岁）、老年组26例（年龄>60岁，平均65±4岁），正中开胸，劈开胸骨前抽取10ml胸骨骨髓，用Ficoll液密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，进行贴壁培养，适时传代，记录原传时间、首次传代时间、平均传代时间；取中年组、老年组各10例冠心病病人骨髓MSCs P1代细胞接种于96孔板，于接种后第2、4、……14天用MTT法490nm波长处测定吸光度，绘制细胞增殖曲线；取生长旺盛之骨髓MSCs进行冻存，中老年组各3例，3-4个月后进行复苏，观察细胞生长与传代情况；老年组6例骨髓MSCs P2代细胞，接种于96孔板，接种24小时细胞完全贴壁后应用低能量激光（0.5，2.0 J/c㎡）对细胞进行照射（Low-Level Lager Irradiation，LLLI），于接种后第2、4、……10天用MTI法测定细胞增殖曲线。
　　 结果：3例老年冠心病病人无明显骨髓液抽出，劈开胸骨后发现骨质疏松明显，骨髓腔呈空洞样改变；23例中年冠心病病人及23例老年冠心病病人骨髓液经Ficoll液分离离心能获得107数量级单个核细胞。贴壁培养后骨髓MSCs呈梭型生长，并能进行传代，最多传代超过15代，培养时间超过92天。随着年龄增加，老年组原传时间、传P1时间、P1-P6平均传代时间均延长（P<0.05）。培养过程中，未能达到原传，以及传代过程中失去传代能力情况随着年龄增加以及传代次数增加而增加，虽P>0.05，但老年组更为明显；增殖曲线显示，从第4、6天开始细胞增殖加速，与中年组的骨髓MSCs增殖曲线相比，老年组的骨髓MSCs增殖较中年组减慢，第1 2、1 4天P<0.05，有统计学意义（n=10）。冻存细胞复苏后仍能进行生长传代，细胞形态及传代能力与冻存前无明显变化。接受低能量激光照射后，骨髓MSCs增殖曲线显示，第4、6、8、10天0.5J/c㎡及2J/c㎡能量组细胞增殖均显著快于对照组，P<0.05（n=6），但两照射组之间无显著性差异，P>0.05。
　　 结论：本研究证实了从冠心病人的胸骨分离培养骨髓MSCs的方法是可行的，但骨髓MSCs的增殖能力随年龄及传代次数的增加而逐渐降低，因此，细胞移植应选择适宜的细胞代数，并需通过增加骨髓抽取量或采取更合适的培养方法，以期获得生长旺盛并且足够数量的移植细胞。骨髓MSCs冻存技术确实可行，有望提前为病人准备足够数量生长旺盛的细胞，可为高龄冠心病病人细胞移植提前准备好骨髓MSCs，甚至提供自体年轻的骨髓MSCs。低能量激光干预能促进MSCs增殖，提示可以通过体外对MSCs进行相应干预，加速细胞增殖，增加细胞数量，缩短细胞培养时间。

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结论

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综述 骨髓间充质干细胞研究进展

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