EphA2/EphrinA1在肾癌中的表达及其在转移中的作用机制研究

摘要

肾癌是起源于肾小管上皮细胞的恶性肿瘤，占肾脏恶性肿瘤的80％～90％，成人恶性肿瘤的2％～3％。随着生活水平的提高和医学影像学的进步，在早期诊断和早期手术方面均取得满意效果。但对于术后复发和伴有转移灶的晚期肾癌患者目前尚缺乏较好的治疗方案，临床上通常以临床分期和病理分级作为判断预后的依据，有一定的局限性。因此，寻找预测肾癌恶性程度的生物学标记物，已成为肾癌研究的热点，以便为肾癌的生物治疗提供新靶点和新思路。
　　 促红细胞生成素产生肝细胞受体（Eph）家族是一类新发现的酪氨酸蛋白激酶受体（RTKs）。EphA2是其中最早被发现的一个成员，在正常上皮细胞中表达，广泛高表达于不同的肿瘤组织（乳腺癌、结肠癌、食管癌、前列腺癌、恶性间皮癌等）和细胞系。EphA2在正常上皮细胞中位于细胞连接处，配体EphrinA1能以较高的亲和力与EphA2结合，两者结合后能导致受体和配体均发生酪氨酸磷酸化而产生双向信号传导，通过其下游信号调节细胞正常的生长、发育，同时也促进EphA2受体自身的降解。在恶性肿瘤细胞中EphA2定位异常，由细胞连接处转变为广泛分布于细胞表面，导致EphA2难以有效的与其配体接触，因而其自身的降解减少，所以在许多侵袭性肿瘤中EphA2和EphrinA1通常是过表达的。有学者通过一种模拟配体EphrinA1-Fc干预肿瘤细胞株（PC-3、293、Cos-7），显示EphA2受体活化、磷酸化程度增强，细胞形态学发生变化。因此，EphA2在肿瘤研究中被学者广泛关注。
　　 有报道，肾癌组织中EphA2高表达可能与肾癌术后无瘤生存期有关，但关于EphA2及配体EphrinA1相互作用的生物学变化及配受体在肾癌中表达和机制研究国内外报道较少。一般认为肿瘤组织类型及恶性程度与疾病的转归和预后有关，在肾癌的不同病理类型中以肾透明细胞癌所占比例较高，为此，本课题通过对EphA2及其配体EphrinA1在肾透明细胞癌组织中的表达及与肾癌临床病理特征、E-cadherin和微血管密度（MVD）关系的研究，探讨EphA2及其配体EphrinA1在肾癌转移中的作用；并通过人工配体EphrinA1-Fc对人肾透明细胞癌786-O细胞系和裸鼠人肾癌细胞移植瘤干预和治疗研究，探讨EphA2与配体EphrinA1结合的生物学效应及其抗肿瘤的分子机制，为EphA2/EphrinA1在肾癌中表达及其在肾癌转移中的作用机制研究提供实验依据。
　　 第一部分 EphA2/EphrinA1在肾癌中的表达及生物学意义
　　 目的：通过检测EphA2、EphrinA1在正常肾组织和肾透明细胞癌组织中蛋白和基因表达情况，探讨其在肾癌高表达的机制。
　　 方法：采用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和流式细胞术检测22例肾癌组织和12例非肾癌正常肾组织中EphA2和EphrinA1的基因及蛋白表达情况，并对其进行比较和相关分析。
　　 小结：EphA2和EphrinA1蛋白高表达于肾癌组织，其机制除与基因表达上调有关外，蛋白质生物学异常也可能是导致其升高的重要因素，提示EphA2和EphrinA1蛋白高表达在肿瘤发病中可能具有重要意义。
　　 第二部分 EphA2/EphrinA1在肾癌转移中的作用
　　 目的：通过对EphA2及其配体EphrinA1在肾癌组织中的表达与肾癌患者临床病理特征、E-cadherin和MVD的关系研究，探讨EphA2及其配体EphrinA1在肾癌转移中的作用。
　　 方法：利用免疫组织化学法检测68例肾透明癌组织、24例正常肾组织中EphA2、EphrinA1和E-cadherin的表达；并采用CD34抗体标记微血管内皮细胞，计算微血管密度（MVD）。分析EphA2、EphrinA1蛋白的表达与肾癌临床病理特征、E-cadherin、MVD之间的关系。
　　 小结：EphA2和EphrinA1蛋白高表达于肿瘤高分期组、高分级组和淋巴结转移组，与E-cadherin蛋白表达呈显著负相关，与MVD呈显著正相关，提示EphA2和EphrinA1蛋白的高表达预示肿瘤恶性程度的增加，其机制可能通过影响或协同E-cadherin和微血管生成来实现的。
　　 第三部分 EphrinA1-Fc对人肾透明癌786-O细胞系抗肿瘤效应机制的研究
　　 目的：通过人工可溶性配体EphrinA1-Fc干预人肾透明细胞癌786-O细胞系抗肿瘤效应及其分子机制的实验研究，探讨EphA2在肿瘤细胞增殖、转移中的作用及机制。
　　 方法：应用可溶性配体EphrinA1-Fc对人肾透明细胞癌786-O细胞系进行体外干预实验，观察不同时间点细胞形态学的变化，对不同时间点细胞内EphA2和ERK1/2的磷酸化程度进行分析，并观察可溶性配体反复刺激786-O后的细胞增殖情况。
　　 小结：EphrinA1-Fc能抑制786-O细胞株的增殖、降低细胞黏附，其机制可能是通过影响胞内EphA2、ERK磷酸化实现的。
　　 第四部分 EphrinA1-Fc对裸鼠人肾癌细胞移植瘤的影响
　　 目的：探讨EphrinA1-Fc对裸鼠人肾癌细胞移植瘤的影响及其作用机制。
　　 方法：将表达EphA2抗原阳性的人肾透明细胞癌786-O细胞株体外培养后接种于裸鼠皮下，建立动物移植瘤模型，观察实验组（瘤周注射EphrinA1-Fc）和对照组（瘤周注射IgG-Fc）移植瘤的生长情况，并采用免疫组化法检测EphA2、E-cadherin及MVD的表达情况。
　　 小结：表达EphA2阳性的肾透明细胞癌786-O具有致瘤性，但成瘤率低且成瘤时间长；瘤周注射EphrinA1-Fc可抑制肿瘤细胞的生长，其机制可能通过增加E-cadherin蛋白表达和抑制肿瘤血管生成实现的，反证了EphA2和EphrinA1的高表达可能通过促进细胞增殖、降低细胞与细胞黏附、促进血管生成促进人类肾癌的发生。
　　 结论：
　　 1、EphA2/EphrinA1基因和蛋白高表达于肾癌组织。其蛋白高表达的机制可能是自身降解下降、基因表达上调共同参与的结果。
　　 2、EphA2/EphrinA1基因和蛋白高表达促进了肾癌细胞增殖、肿瘤新生血管生成，增强了肿瘤细胞与ECM黏附，削弱了细胞间连接，从而促进人类肾癌的发生和转移。
　　 3、人工可溶性配体EphrinA1-Fc能抑制肾癌细胞的生长，为生物靶向治疗提供了动物实验依据。
　　 4、EphA2和EphrinA1蛋白的高表达预示肾癌细胞侵袭能力强。联合检测EphA2、EphrinA1和E-cadherin三种蛋白的表达对于评价肾癌的恶性程度、判断其转移的危险性，可能具有一定的参考价值。

目录

文摘

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论文说明：英文缩写

声明

引言

第一部分 EphA2/Ephr inA1在肾癌中的表达及生物学意义

前言

材料与方法

结果

附图

附表

试论

小结

参考文献

第二部分EphA2/EphrinA1在肾癌转移中的作用

前言

材料与方法

结果

附录

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 EphrinA1-Fc对人肾透明细胞癌786-O细胞系抗肿瘤效应机制的研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分 EphrinA1-Fc对裸鼠人肾癌细胞移植瘤的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 EphA2与肿瘤关系的研究进展

致谢

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