旋覆花总黄酮抑制血管平滑肌细胞氧化应激和新生内膜形成的分子机制

摘要

当血管内皮损伤时，局部募集的炎性细胞可产生大量的活性氧分子（ROS），而ROS又可作为刺激因素，进一步激活血管平滑肌细胞（VSMC）的迁移、增殖、凋亡及细胞外基质分泌等一系列病理事件，导致血管内膜发生肥厚和硬化等病变。因此，寻找新的有效药物，抑制损伤诱导的血管氧化应激反应以及由此引发的心血管疾病己成为药物研发的热点之一。
　　 黄酮类化合物（flavonoids）是自然界中广泛存在的一类酚类物质，是药用植物中的主要活性成分。流行病学研究表明，Flavonoids具有抗炎、抗氧化、抗凝血等生理活性，适量摄取可以降低心血管疾病的发生概率。
　　 欧亚旋覆花（Inula britannica L.）是菊科（compositae）、旋覆花属多年野生草本植物，性味咸、温；入肺、肾经。旋覆花总黄酮（TFE）是旋覆花中含量最多的一类活性成分，其含量约占旋覆花干重的10.9％，主要成分包括槲皮素、木犀草素、芦丁、槲皮苷和异槲皮苷等。其在心血管系统中的抗氧化功效未见报道。本研究观察TFE对内皮剥脱诱导的血管组织氧化应激和新生内膜形成的干预效应，并在细胞和分子水平上探讨其作用机制，旨在挖掘TFE在防治心血管疾病中的药用价值。
　　 1.旋覆花总黄酮抑制损伤诱导的血管组织氧化应激和新生内膜形成研究证实，ROS是内皮损伤诱导的血管内膜增生的一个重要诱发因素，具有抗氧化作用的药物均具有较好的抗血管硬化的临床疗效。TFE具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗凝血、抗衰老、抗肿瘤、降血脂等多种生理活性。然而，TFE对损伤诱导的血管氧化应激和内膜增生的干预效应尚不清楚。本部分研究，以大鼠颈外动脉和腹主动脉球囊剥脱内膜增生模型为对象，观察TFE对损伤诱导的血管氧化应激和内膜增生的抑制效应和相互关系。
　　 1.1球囊损伤诱导血管内膜增生
　　 形态学分析显示，球囊剥脱内皮3天后，血管损伤局部有大量血小板聚集，第7天时内膜出现增厚，14天时增生达到峰值，可见血管内膜向腔内凸起，细胞增多且排列紊乱，内膜呈现弥散性增厚。形态测量学分析显示，术后第7天，I/M比值开始升高；14天时，I/M比值较对照组增加50倍左右。表明本实验复制的球囊剥脱内膜增生模型是成功的。
　　 1.2 TFE剂量依赖性抑制球囊损伤诱导的血管内膜增生
　　 为了观察TFE抗内膜增生效应，将制备的TFE乳液于术前3天至术后14天以不同剂量（12.5，25，50 mg/kg/d）灌服大鼠。结果显示，无论是颈总动脉还是腹主动脉，给予高剂量（50 mg/kg/d）TFE组的血管内膜增生程度较模型组明显减轻；抑制效应与阳性对照药物阿托伐他汀（ATO）相似，两组动物的血管腔内径比模型组均明显扩大，而中、低剂量TFE的抗内膜增生效应不明显。
　　 1.3 TFE抑制球囊损伤诱导的血管氧化应激
　　 提示该药物可提高血管组织的抗氧化能力。
　　 1.4 TFE降低大鼠血管组织中超氧阴离子（O2-）的含量
　　 血管组织O2-的生成量变化与内膜增生程度具有正相关关系。
　　 1.5 TFE上调血管组织中SOD蛋白的表达
　　 Western blot分析和免疫组化染色结果显示，从假手术组的血管组织中可检测到较高水平的SOD蛋白；而球囊损伤14天后，血管中SOD含量明显降低，约为对照组的60％左右；给予TFE干预后，血管中的SOD含量有所增加，接近对照组水平，尤其在新生内膜的管腔侧，可见大量的SOD阳性染色颗粒。
　　 1.6 TFE抑制球囊剥脱诱导的VSMC的表型转化
　　 对分化型VSMC标志基因SM22α的Western blot分析显示，球囊损伤不同时间后，SM22α表达量呈进行性下降，表明VSMC由分化型向去分化型转化；给予TFE干预治疗后，损伤诱导的SM22α表达活性降低受到明显抑制，表明该药物可抑制VSMC表型转化。
　　 2.旋覆花总黄酮体外抑制血管平滑肌细胞氧化应激
　　 在动物整体水平上证明TFE能够抑制球囊损伤诱导的血管内膜增生和氧化应激的基础上，为进一步探讨TFE调制血管氧化应激的作用机制，本部分以H2O2为诱导剂，建立VSMC氧化应激模型，给与TFE干预，同时以槲皮素（TFE的主要成分之一）为对照，比较观察两种制剂对VSMC氧化应激的调制效应。
　　 2.1 H2O2对VSMC生长的影响
　　 MTT分析结果表明，低浓度的H2O2（100-400μmol/L）处理VSMC后，不影响细胞活力和生长速度，高浓度的H2O2（>800μmol/L）具有明显的细胞毒性作用。本研究采用200μmol/L H2O2的终浓度用于后续实验。
　　 2.2不同剂量TFE和槲皮素对VSMC生长的影响
　　 结果表明，TFE对细胞增殖的直接抑制效应较弱。
　　 2.3 TFE抑制VSMC中O2-的生成
　　 DHE染色结果显示，200μmol/L H2O2刺激VSMC24 h后，与对照组相比，细胞内红色荧光的亮度明显增强，提示细胞内O2-生成明显增多。
　　 2.4 FFE抑制H2O2诱导的MDA生成
　　 表明TFE和槲皮素均可抑制H2O2诱导的MDA的生成，二者具有相同的功效。
　　 2.5 FFE上调SOD活性
　　 表明TFE和槲皮素均可以部分逆转H2O2导致的SOD活性降低。
　　 3.旋覆花总黄酮抑制血管平滑肌细胞p47phox表达和磷酸化
　　 p47phox的表达活性、磷酸化水平和膜转位速率的变化，均可直接影响细胞ROS的生成。
　　 本研究部分在已经确证TFE具有抑制血管ROS生成，加快O2-清除的基础上，以p47phox为切入点，对TFE减少ROS产生的上游机制进行了探讨。
　　 3.1 H2O2诱导VSMC中p47Phox的表达
　　 结果提示，H2O2对p47phox表达的诱导效应具有浓度和时间依赖性。
　　 3.2 TFE抑制内皮损伤诱导的血管p47phox的表达
　　 免疫组化结果显示，球囊剥脱内皮14天后的血管新生内膜中，可见有大量p47phox阳性染色的VSMC，弥散性分布于新生内膜区：而给予TFE药物的血管，其新生内膜肥厚程度减轻的同时，p47phox阳性的细胞数也大大减少。Western blot分析得到了相似的结果，在球囊损伤3天时，p47Phox水平开始升高，约为对照组的1.9倍；到第14天时达到高峰，约为对照组的4倍左右；预先给予TFE药物干预组，其损伤诱导的p47phox的表达上升被部分抑制，与14天的模型组相比降低50％以上。
　　 3.3 TFE和槲皮素抑制H2O2诱导的VSMC中p47phox的表达
　　 为了在细胞水平上进一步验证TFE对p47phox似表达的抑制效应，用TFE处理VSMC，以槲皮素作为阳性对照。表明TFE和槲皮素可抑制H2O2诱导的VSMC中p47phox的基因转录。
　　 3.4 FFE和槲皮素抑制H2O2诱导的p47phox的磷酸化
　　 免疫沉淀分析结果显示，对照组VSMC中，p47phox的磷酸化水平相对较低，H2O2刺激VSMC15 min、30 min、1 h后，p47phox磷酸化水平快速、短暂升高，于刺激15 min时即达高峰，随后略有降低，但仍高于正常水平。
　　 4.旋覆花总黄酮对ERK1/2、AKT和NF-κB信号通道的调制作用
　　 血管内皮损伤局部募集的炎性细胞除释放多种致炎因子外，还可产生大量的ROS，后者可通过影响胞内信号分子的磷酸化修饰，而诱导细胞产生氧化应激。细胞内有多条信号通路参与介导ROS诱导的p47Phox磷酸化过程。
　　 4.1 FFE和槲皮素抑制内皮损伤和H2O2诱导的ERK1/2的磷酸化
　　 免疫组化和Western blot分析检测了TFE和槲皮素对氧化应激诱导的ERK1/2磷酸化的影响，结果显示，球囊剥脱损伤14天后，模型组大鼠血管新生内膜VSMC中有大量磷酸化ERK1/2阳性染色颗粒；而给药组大鼠新生内膜肥厚程度减轻的同时，血管组织中磷酸化ERK1/2阳性颗粒数量明显减少。
　　 4.2 TFE和槲皮素抑制H2O2诱导的Akt的磷酸化
　　 Western blot结果显示，不同条件处理的VSMC，其总Akt表达量基本一致，但磷酸化Akt的水平存在明显差异。
　　 4.3 TFE和槲皮素能够抑制H2O2诱导的NF-κB p65亚基的核转位
　　 结果表明，TFE和槲皮素可不同程度地抑制H2O2诱导的NF-κB p65的核转位，而槲皮素单体具有更强的抑制效应。
　　 结论:
　　 1.FFE通过上调总SOD蛋白表达和活性、促进O2-的清除，降低球囊损伤诱导的血管氧化应激，进而抑制血管新生内膜形成和由此导致的血管狭窄。
　　 2.TFE可以部分逆转H2O2导致的SOD活性降低、降低MDA水平、促进O2-的清除，从而抑制VSMC氧化应激。
　　 3.TFE可抑制p47phox基因的转录和蛋白表达及磷酸化活化，该效应是TFE减少ROS生成和抑制氧化应激的分子机制之一。
　　 4.TFE对ROS诱导的ERK1/2、Akt和NF-κB信号通路的激活具有不同程度的调制作用，这是该药物抗血管氧化应激反应的作用途径之一。
　　 5.TFE是一种有效的血管保护制剂，通过抗氧化而减轻血管内皮损伤和内膜增生程度。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写

声明

引言

第一部分 旋覆花总黄酮抑制损伤诱导的血管组织氧化应激和新生内膜形成

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分旋覆花总黄酮抑制血管平滑肌细胞氧化应激

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分旋覆花总黄酮抑制血管平滑肌细胞p47phox表达和磷酸化

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第四部分 旋覆花总黄酮对ERK1/2、AKT和NF-κB信号通道的调制作用

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

综述 NAD(P)H氧化酶的组成亚基及相互作用是血管组织活性氧分子产生的主要途径

致谢

个人简历