二烯丙基三硫对内毒素致急性肺损伤的抗氧化机制研究

摘要

目的：急性肺损伤(acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫综合征(acute repiratory distress syndrome，ARDS)是指严重感染、创伤、休克等肺内外疾病后出现的以肺泡毛细血管内皮和肺泡上皮损伤为主要表现,以急性、进行性、顽固性低氧血症为特征的临床综合征。后期多并发多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)。ALI是ARDS的早期阶段。革兰氏阴性杆菌内毒素是导致ALI/ARDS最常见的原因。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性细菌内毒素的主要成分，是动物ALI/ARDS模型制备最常用的致伤剂。LPS可以引起肺泡毛细血管内皮和肺泡上皮损伤，肺微血管通透性增高，肺水肿及透明膜形成。因此，注射LPS不仅可以成功复制ALI/ARDS模型，而且可以很好的模拟临床严重感染引发的ALI/ARDS。
　　 ALI的发病机制复杂,至今尚未完全阐明。多数学者认为肺部氧化/抗氧化平衡失调在ALI病程中起主要作用。当肺脏受创伤，休克，感染等各种致病因素的严重打击时，可导致肺内皮细胞、血管平滑肌细胞通过非酶促反应生成大量的活性氧类或氧自由基(reactive oxygen species,ROS)，进而导致ALI。各种途径产生的O2或H2O2在正常情况下可通过酶解或谷胱甘肽过氧物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)作用生成水。因此GSH-PX在ROS代谢过程中具有重要调节作用。另一类具有氧化作用的是活性氮类自由基(reactive nitrogen species,RNS)或氮自由基类，其中一氧化氮(nitrogen monoxidum，NO)和NO合酶(NOS)具有重要作用。在体内NO由L-精氨酸在NOS催化下转化而来的。NOS可在包括气道和肺泡的上皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞以及平滑肌细胞等多种细胞中表达，并通过抗氧化机制在ALI/ARDS发生发展中具有重要作用。
　　 有研究证实二烯丙基三硫(diallyl trisulfide,DATS)作为大蒜提取物主要有效活性成分，具有广谱抗菌消炎，抗氧化的作用。文献报道预防性应用DATS对于LPS诱导的ALI小鼠急性肺损伤具有保护作用，这提示DATS可能对ALI/ARDS具有潜在的防治作用。但DATS是否可减轻ALI时的氧化应激反应，相关的文献报道却很少。因此，本研究选用LPS作为致伤剂复制小鼠ALI动物模型，研究DATS对肺组织中NO、NOS及GSH-PX的影响，以期进一步为临床防治ALI/ARDS提供实验理论依据。
　　 方法：实验动物选择健康昆明小鼠共48只。随机分为4组：(1)ALI组，每天腹腔注射与DATS等体积生理盐水一次，连续注射7天后，腹腔注射LPS 10mg/kg；(2)DATS预防组，每天腹腔注射(2mg/ml)DATS 30mg/kg一次，连续注射7天后，腹腔注射LPS 10mg/kg；(3)DATS治疗组，每天腹腔注射与DATS等体积生理盐水一次，连续注射7天后，腹腔注射LPS10mg/kg，之后30min再腹腔注射(2mg/ml)DATS30mg/kg一次；(4)生理盐水对照组，每天腹腔注射与DATS等体积生理盐水一次，连续注射7天。各组动物(n=6)均按2h、6h两个时间点脱颈处死，取部分肺组织液氮保存，待测NO、NOS以及GSH-PX；用化学法，检测各组肺组织NO、GSH-PX的含量；并用免疫组化法测定NOS的含量。用SPSS13.0统计分析软件进行统计学分析，数据用均数±标准差(±s)表示，多组均数比较行单因素方差分析(ANOVA)，两两比较用最小显著差法(least significant difference，LSD)；各两组均数比较行两个独立样本t检验(independent samples t Test)，P＜0.05为有显著性差异。
　　 结果：
　　 1 肺水的变化
　　 ALI组，2h时肺W/D较对照组无明显变化(P>0.05)，6h时肺W/D较对照组显著升高(P<0.05)，表明出现肺水肿。6h时，DATS预防组肺W/D与ALI组相比显著下降(P<0.05)，但DATS治疗组与ALI组相比肺W/D无明显改善(P>0.05)。单独注射DATS组与对照组无明显差异(P>0.05)。
　　 2 肺组织NO的表达
　　 注射LPS 2h、6h后，ALI组肺组织NO的表达均明显高于对照组(P<0.05)。DATS预防组与ALI组相比，肺组织NO的表达在2h显著降低(P<0.05)，但在6h无明显变化 (P>0.05)。DATS治疗组肺组织NO的表达与ALI组相比在2h显著升高(P<0.05)，但是在6h显著降低(P<0.05)。ALI组、DATS预防组和DATS治疗组肺组织内NO表达在6h均比2h明显升高(P<0.05)。
　　 3 肺组织NOS的表达
　　 注射LPS 2h、6h后，ALI组肺组织NOS的表达与对照组相比无显著变化(P＞0.05)。DATS预防组与ALI组相比，肺组织NOS的表达在2h显著升高(P<0.05)，在6h也明显升高明显 (P<0.05)。DATS治疗组肺组织NOS的表达与ALI组相比在2h显著升高(P<0.05)，但是在6h显著降低(P<0.05)。ALI组、DATS预防组和DATS治疗组肺组织内NOS表达6h均比2h明显降低(P<0.05)。
　　 4 肺组织GSH-Px的表达
　　 注射LPS 2h、6h后，ALI组肺组织GSH-Px的表达在2h明显升高(P<0.05)，而在6h无明显变化(P>0.05)。DATS预防组与ALI组相比，肺组织GSH-Px的表达均降低(P<0.05)。DATS治疗组肺组织GSH-Px的表达与ALI组相比在2h时明显减低(P<0.05)，而在6h时无明显差异(P>0.05)。ALI组、DATS预防组和DATS治疗组肺组织内GSH-Px 6h均比2h明显升高(P<0.05)。6h组时各组肺组织内GSH-Px的表达量无差异(P>0.05)。
　　 结论：
　　 1 预防性应用DATS可减轻LPS诱导的ALI小鼠肺水肿程度及肺组织炎症反应。
　　 2 LPS可诱导的ALI小鼠肺组织NO和NOS表达增多，预防性应用DATS在早期，治疗性应用DATS在晚期可降低NO、NOS，具有一定的抗氧化作用。
　　 3 LPS可诱导的ALI小鼠肺组织GSH-Px表达增多，预防性及治疗性应用DATS在早期可降低GSH-Px表达程度，具有一定的抗氧化作用。