利用MALDI-TOF MS技术检测乳腺癌患者血清蛋白指纹图谱并建立乳腺癌诊断模型

摘要

目的:利用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(matrix-assistedlaser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALD-TOFMS)技术检测血清样本蛋白多肽表达图谱,分析clinprot实验方法的重复性及血清不同的冻融次数对实验结果的影响,以便建立MALDI-TOF MS检测方法用于后续试验;同时比较分析弱阳离子交换磁珠(MB-WCX)、铜离子螯合磁珠(MB-IMAC Cu)、疏水C8磁珠(MB-HIC C8)进行血清蛋白多肽分离富集后图谱采集的差异,选取分离蛋白质能力强的MB-WCX对乳腺癌及健康对照组的血清样本进行检测,通过高通量分析软件进行数据处理,筛选出乳腺癌和健康对照组之间的差异蛋白多肽质荷比峰,并建立乳腺癌诊断模型,进行模型验证确定诊断模型具有高度灵敏度和特异度,为临床寻找乳腺癌血清肿瘤标志物提供理论依据。
　　 方法:1采用MB-WCX分别对冻融1、3、5次后的血清样本分离提纯,经MALDI-TOF MS检测后比较其蛋白质图谱,以此判断冻融次数对实验结果的影响。
　　 2采用MB-WCX进行血清样本蛋白分离提纯,经MALDI-TOF MS检测后,选择不同分子量范围的9个蛋白重复测定,比较组间和组内变异系数以考察重复性。
　　 3比较MB-WCX、MB-IMAC Cu、MB-HIC C8的平均出峰量、平均峰面积和平均峰强度等参数,从而选取分离蛋白质能力较好的一种磁珠用于大量血清样本的提纯。
　　 4选择分离蛋白质能力较好的MB-WCX对乳腺癌及健康对照组的血清样本进行检测,然后用MALDI-TOF MS检测不同组患者蛋白质谱图并加以对比分析。研究过程中仪器操作、数据分析和图像采集分别用flexControlMS3.0、ClinProToolsTM2.1和flexAnalysis3.0软件。对所发现的差异蛋白计算识别率、预测能力和验证准确率,或差异蛋白组合后诊断的效果,以指导临床应用。
　　 结果:1研究发现,样品的冻融次数在3次以内不影响质谱峰的采集,没有显著性差异(P＞0.05),冻融次数越多,对小分子量蛋白或多肽的影响越大。
　　 2重复性研究表明,标准品变异系数范围在10.67％～29.59％,混合样品变异系数范围在9.88％～30.07％,重复性很好。
　　 3相同样本利用MB-WCX处理后的平均出峰量和平均峰面积均明显优于MB-IMAC-Cu、MB-HIC C8(P＜0.05)。
　　 4应用MB-WCX与MALDI-TOF MS检测到15个明显差异表达的蛋白质峰,分子量分别为4964.52Da、7765.28Da、3261.95Da、1621.2Da、3192.55Da、7008.09Da、2288.99Da、1741.74Da、3225.04Da、4363.01Da、6910.35Da、7631.46Da、3935.34Da、8140.66Da、4054.5Da。
　　 5分子量分别为4964.52Da和7765.28Da的2个蛋白质峰的差异最显著,在乳腺癌患者中的表达上调,有可能成为潜在的乳腺癌早期诊断标志物。
　　 6利用差异蛋白质峰建立乳腺癌诊断模型后应用QC(快速分类算法)、GA(遗传算法)和SNN(神经网络算法)对模型进行验证,得到该模型区分乳腺癌患者和健康者的灵敏度和特异度均高于80％。
　　 结论:1 MALDI-TOF MS作为一种高灵敏度的研究平台,严格操作规程减少冻融次数能够减少变异,提高检测结果的重复性和可信性。
　　 2 MB-WCX的蛋白分离效果优于MB-IMAC-Cu和MB-HIC C8;
　　 3利用MALDI-TOF MS技术可以建立高度敏感性和特异性的乳腺癌诊断模型。

目录

文摘

英文文摘

引言

第一部分 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱实验条件的优化

前言

材料与方法

结果

附图、附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 利用MALDI-TOF MS技术检测乳腺癌患者血清蛋白指纹图谱并建立诊断模型

前言

材料与方法

结果

附图、附表

讨论

小结

参考文献

综述 蛋白质组学及其在肿瘤标志物筛选中的应用

致谢

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