CD40L转染小鼠结肠癌细胞致敏树突状细胞抗肿瘤作用的研究

摘要

目的:采用小鼠结肠癌细胞为研究对象。研究转染CD40L基因的小鼠结肠癌细胞抗肿瘤效应,以及表达CD40L基因的肿瘤细胞诱导骨髓起源的树突状细胞(dendritic cells,DC)产生免疫抗肿瘤作用的情况,分析CD40L基因及其瘤苗在结肠癌治疗中的效果及作用机制,探讨表达CD40L基因的肿瘤细胞和DC细胞相互作用的关系,为CD40L基因修饰疫苗在结肠癌的临床治疗研究提供理论依据。
　　 方法:
　　 1 CD40L真核表达载体的扩增、鉴定与大量制备将pMKITneo-CD40L质粒转化DH5α感受态菌株进行扩增,采用质粒提取试剂盒提取质粒,用限制性内切核酸酶EcoRⅠ酶切鉴定、PCR鉴定及质粒测序分析鉴定。将鉴定符合实验条件的质粒进行大量制备。
　　 2细胞培养和质粒转染及筛选稳定转染的细胞系采用脂质体转染法将全长的小鼠CD40L基因转染入结肠癌细胞株colon26中,用G418筛选抗药性克隆,并以相同的方法得到空载体转染细胞。
　　 3细胞转染效率测定用流式细胞术检测各组细胞CD40L的表达。分别用半定量RT-PCR法、激光共聚焦显微镜、Western印迹法检测各组细胞CD40L mRNA及蛋白的表达。
　　 4转染CD40L基因对细胞增殖的影响测定用MTS法测定各组细胞的增殖情况,并绘制细胞生长曲线。
　　 5转染CD40L基因对细胞侵袭能力的影响测定用半定量RT-PCR法检测各组细胞MMP-2 mRNA的表达。用Transwell法测定各组细胞的侵袭能力。
　　 6小鼠骨髓源性DC的制备取BALB/c雌性小鼠的胫骨和股骨骨髓细胞,在含GM-CSF、IL-4的10％FCS RPMI-1640中培养7天。收集非黏附的细胞并用CD11c+磁珠进行筛选,筛选后细胞用作DC。流式细胞术检测DC细胞表面CD11c的表达。
　　 7肿瘤细胞与DC共培养对DC功能的影响测定将各组细胞与DC共培养24 h后,流式细胞术检测DC细胞表面CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ的表达;用半定量RT-PCR法检测IL-12、IL-23、IL-18、IFN-γ、IFN-γ(Mig)基因mRNA的表达;用ELISA法检测共培养上清中IL-12、IL-23、IFN-γ的释放量。
　　 8荷瘤小鼠模型的建立收集呈对数生长期的colon26细胞,制成细胞悬液,调整细胞浓度为1×107/ml,于BALB/c小鼠右侧肩背部皮下注射细胞悬液0.1 ml,1×106/只,建立荷瘤小鼠模型。
　　 9 CD40L基因瘤苗的体内抑瘤作用在荷瘤小鼠模型建立后,于荷瘤小鼠腹腔分别注射DC、CD40L基因瘤苗、DC联合CD40L基因瘤苗(实验组)或PBS(对照组),每组5只。观察肿瘤大小变化及治疗效果,经3次治疗后处死小鼠,留取血清、肿瘤、肝、脾组织用于后续实验。
　　 10用ELISA法检测荷瘤小鼠外周血中IL-12、IL-23、IFN-γ、IL-10、TGF-β的水平。
　　 11经HE染色,显微镜下观察肿瘤组织有无炎细胞浸润,观察肝、脾的组织病理学变化以及有无肿瘤细胞浸润。
　　 结果:
　　 1经酶切和PCR鉴定扩增质粒及含目的基因分子大小与已知质粒相同,扩增质粒所测核苷酸序列与已知的核苷酸序列相同。
　　 2经筛选分别得到了稳定转染CD40L基因和空载体基因的细胞系,转染细胞形态较野生型细胞无明显变化,细胞呈梭形生长,形态饱满。
　　 3经流式细胞术检测,转染CD40L基因后colon26/CD40L细胞CD40L表达率较colon26和colon26/vector增加;与colon26/vector和colon26相比,colon26/CD40L组细胞中CD40L mRNA表达量分别上调了45.32％和44.81％(P＜0.05),而colon26/vector和colon26相比,差异无统计学意义(P＞0.05);在激光共聚焦显微镜下可观察到colon26/CD40L组细胞CD40L表达较colon26/vector和colon26高;同时,Western印迹法也证实colon26/CD40L组细胞CD40L蛋白较colon26/vector和colon26分别上调了52.34％和53.58％(P＜0.05),而colon26/vector和colon26相比,差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 4利用MTS法检测结果显示,colon26、colon26/vector和colon26/CD40L三组细胞在体外生长及细胞增殖无明显差别(P＞0.05)。
　　 5经半定量RT-PCR法检测结果显示,colon26/CD40L组细胞较colon26/vector和colon26组细胞MMP-2 mRNA的表达减弱(P＜0.05);经苏木素染色观察,colon26/CD40L组细胞穿过Transwell小室较colon26/vector和colon26组细胞少(P＜0.05)。
　　 6小鼠骨髓源性DC在体外培养过程中,细胞逐渐呈悬浮状态,细胞边缘可见不规则树突状突起,在培养第7天时用CD11C+磁珠进行筛选,筛选后CD11c+ DC纯度可达92.88％。
　　 7与colon26/CD40L共培养后,DC细胞表面CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ分子表达显著提高,与其它组比较有显著性差异;DC与colon26/CD40L,共培养组有IL-12、IL-23、IL-18、IFN-γ、IFN-γ(Mig)基因mRNA的表达,在其它组未见;DC与colon26/CD40L共培养组上清中IL-12、IL-23、IFN-γ,的释放量高于DC与colon26共培养组和DC组(P＜0.05)。
　　 8成功建立colon26荷瘤小鼠模型。
　　 9经过3次治疗后,colon26/CD40L与DC联合治疗组荷瘤小鼠肿瘤比colon26/CD40L治疗组、DC治疗组、对照组减小(P＜0.05),colon26/CD40L与DC联合治疗组抑瘤率为47.92％;colon26/CD40L治疗组、DC治疗组、对照组抑瘤率分别为32.95％、32.26％和0％。
　　 10 colon26/CD40L与DC联合治疗组荷瘤小鼠外周血血清中IL-12、IL-23、IFN-γ高于colon26/CD40L治疗组、DC治疗组和对照组,IL-10和TGF-β则呈较低水平(P＜0.05)。
　　 11 HE染色结果显示,colon26/CD40L瘤苗治疗组、DC治疗组的肿瘤组织切片中可见到大量的肿瘤细胞,病灶周围有少量炎性细胞浸润,有坏死灶;而在联合治疗组肿瘤病灶内有大量炎性细胞浸润,并伴有大片坏死,肿瘤细胞散在分布,肿瘤局限化。以上三组均未发现肝、脾转移。对照组肿瘤组织切片中可见大量肿瘤细胞,但只见极少量炎细胞浸润,并可在肝、脾组织中发现转移灶。
　　 结论:表达CD40L的结肠癌细胞有利于DC和肿瘤细胞的相互作用,促进了DC的成熟,诱导了Th1型细胞因子的分泌,产生了T细胞依赖的抗肿瘤免疫反应。DC-CD40L-肿瘤细胞瘤苗有望成为结肠癌免疫治疗的一种新策略。

目录

文摘

英文文摘

引言

第一部分 表达CD40L结肠癌细胞的生物学特性的研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

第二部分 表达CD40L基因的结肠癌细胞诱导树突状细胞成熟及细胞因子分泌的抗肿瘤效应的研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 基因修饰的树突状细胞应用于肿瘤免疫治疗的研究进展

致谢

个人简历