大蒜素对全脑缺血再灌注大鼠海马凋亡相关蛋白及细胞间黏附分子-1表达的影响

摘要

目的：脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)的机制非常复杂，涉及到氧自由基的产生、钙超载、炎症介质释放以及细胞凋亡等诸多因素。细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion moleculesl，ICAM-1)是一种重要的促炎因子，在缺血再灌注损伤中发挥重要作用。Bcl-2(B细胞淋巴瘤/白血病-2，B-cell leukemia-lymphoma-2)、bax(Bcl-2associatedXprotein)以及调亡蛋白酶半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)都是细胞凋亡过程中起重要作用的因子，在细胞凋亡过程中分别发挥抑制凋亡和促进凋亡的作用。
　　 大蒜素(Allicin，All)又名大蒜新素(Allitridi)，其具有脂溶性，易于通过血脑屏障，故在临床防治脑缺血以及缺血再灌注损伤方面的作用倍受关注。近些年的研究证实，大蒜素具有减少活性氧的产生、抑制钙超载、调节机体免疫功能等多种功效。我室的研究发现，大蒜素可防止CIRI诱导的海马神经元发生凋亡，但其对于缺血再灌注脑组织保护作用的详细机制尚缺乏深入的研究。因此，在我室以往研究的基础上，本实验观察了大蒜素对CIRI的海马组织调亡蛋白酶Caspases-3以及调亡相关蛋白Bcl-2和Bax的影响，并观察了其对于脑缺血再灌注引起的ICAM-1表达的影响，探讨大蒜素对缺血再灌注脑组织保护作用的详细机制，为大蒜素临床应用提供实验依据。
　　 方法：采用健康雄性Wistar大鼠30只，体重280～320g，由河北医科大学实验动物中心提供，将动物随机分为5组：①假手术(Sham)组，②缺血-再灌注(I/R)组，③缺血/再灌注+大蒜素10mg/kg(I/R+All-10mg/kg)组，④缺血/再灌注+大蒜素20mg/kg(I/R+All-20mg/kg)组，⑤缺血/再灌注+大蒜素30mg/kg(I/R+All-30mg/kg)组，每组6只动物。
　　 Sham组只凝闭双侧椎动脉，分离暴露但不夹闭颈总动脉；I/R组凝闭双侧椎动脉，48h后夹闭双侧颈总动脉8min，而后恢复血流灌注；③～⑤组动物分两次（缺血前30min及再灌注后10min）经尾静脉给予大蒜素注射液，其他过程同I/R组，Sham组及I/R组于缺血前30min及再灌注后10min给予等体积5％葡萄糖注射液。各组动物均于再灌注后24h断头取海马组织，用于指标观察。
　　 参照Kato分级方法，在光学显微镜下对海马CA1区组织学改变进行分级(Histological grade，HG)。0级，无神经元死亡；1级，有散在的神经元死亡；2级，成片神经元死亡；3级，几乎全部的神经元死亡。取双侧海马平均等级作为统计值。
　　 于高倍光学显微镜下计数海马CA1区每1mm区段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目，每张切片双侧海马各计数3个区段，取平均值作为每一例的存活神经元密度值( Neuronal density, ND)。
　　 采用免疫组化方法检测Caspases-3、Bcl-2、Bax以及ICAM-1的表达，通过测定海马CA1区Caspases-3、Bcl-2、Bax以及ICAM-1免疫反应阳性细胞面积和积分光密度值，用于反应Caspases-3、Bcl-2、Bax以及ICAM-1表达的改变。
　　 结果：
　　 1大蒜素对脑缺血再灌注大鼠海马组织学分级以及存活神经元密度的影响
　　 Sham组大鼠海马CA1区锥体细胞排列整齐，几乎无锥体细胞缺失现象，6例中，5例组织学分级为0级，仅一例为1级。存活神经元密度值较高。I/R组大鼠海马CA1区神经元排列松散，有明显的细胞缺失，存留细胞中部分细胞胞体形态不规则，呈多角型或梭型，胞膜皱缩，胞核固缩浓染，组织学分级为1～2级，与Sham组比较，存活神经元密度值明显降低。I/R+All-10mg组、I/R+All-20mg/kg组及I/R+All-30mg/kg组大鼠海马CA1区锥体细胞排列情况和细胞形态均较I/R组明显改善，组织学分级均明显降低，表明组织损伤较轻，存活神经元密度值明显增加，其中以I/R+All-20mg/kg组改善最为明显。
　　 2大蒜素对脑缺血再灌注大鼠海马Bcl-2蛋白表达的影响
　　 Sham组海马CA1区Bcl-2蛋白有一定的基础表达，与Sham组比较，I/R组海马Bcl-2蛋白表达减少，表现为阳性细胞面积减小和阳性细胞积分光密度值降低，但与Sham组相比无统计学意义；与I/R组比较，I/R+All-10mg/kg组、I/R+All-20mg/kg组和I/R+All-30mg/kg组Bcl-2阳性细胞面积均明显增加，阳性细胞积分光密度值也明显增加，表明Bcl-2蛋白表达明显增多，其中以I/R+All-20mg/kg组Bcl-2表达增加最为明显。
　　 3大蒜素对脑缺血再灌注大鼠海马Bax蛋白表达的影响
　　 Sham组大鼠海马CA1区有少量Bax蛋白表达。与Sham组比较，I/R组大鼠海马Bax蛋白表达明显增加，可见大量深染的棕黄色的神经元细胞，胞质内Bax蛋白免疫阳性颗粒丰富，部分轴突着色，阳性细胞面积和阳性细胞的积分光密度值均明显增加。与I/R组比较，I/R+All-10mg/kg组、I/R+All-20mg/kg组和I/R+All-30mg/kg组大鼠海马Bax表达均明显减少，其中以I/R+All-20mg/kg组的表达减少最为显著。
　　 4大蒜素对脑缺血再灌注大鼠海马Caspases-3表达的影响
　　 Sham组大鼠海马CA1区Caspases-3蛋白表达量很少，与Sham组比较，I/R组则表现为Caspases-3蛋白的高表达，细胞深染呈现深褐色，胞质内阳性标记物丰富，部分轴突明显着色，阳性细胞面积和积分光密度值均明显增加；与I/R组比较，I/R+All-10mg/kg组、I/R+All-20mg/kg组和I/R+All-30mg/kg组Caspases-3表达均有所减少，阳性细胞面积和积分光密度值均明显降低，其中以I/R+All-20mg/kg组Caspases-3蛋白表达减少最为明显。
　　 5大蒜素对脑缺血再灌注大鼠海马ICAM-1表达的影响
　　 Sham组大鼠海马CA1区ICAM-1仅有少量表达，与Sham组比较，I/R组ICAM-1表达明显增加，表现为阳性数量增加，染色加深，阳性细胞的面积和积分光密度值均有所增加。与I/R组比较，I/R+All-10mg/kg组、I/R+All-20mg/kg组和I/R+All-30mg/kg组ICAM-1表达均明显减少，表现为ICAM-1免疫反应阳性细胞面积和阳性细胞的积分光密度值均减少，其中以I/R+All-20mg/kg组减少最为显著。
　　 结论：
　　 1静脉给予大蒜素预处理，可使全脑缺血再灌注大鼠海马组织学改变明显改善，存活神经元数目增加，表明大蒜素对大鼠全脑缺血再灌注海马组织具有明显的保护作用。
　　 2给予大蒜素预处理可使全脑缺血再灌注大鼠海马Bcl-2蛋白表达明显增加，Bax和Casepase-3表达显著较少，表明大蒜素可通过影响凋亡相关蛋白的表达，抑制细胞凋亡而发挥脑保护作用。
　　 3本实验还证实，大蒜素预处理可使全脑缺血再灌注大鼠海马组织ICAM-1表达明显减少，这可能是大蒜素发挥脑保护作用的另一环节。

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大蒜素对全脑缺血再灌注大鼠海马凋亡相关蛋白及细胞间黏附分子-1表达的影响

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结果

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结论

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综述 大蒜素抑制脑缺血再灌注诱导细胞凋亡机制的研究进展

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