化浊解毒调肝方对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1及Smad3表达影响的研究

摘要

目的：本实验通过无菌未灭活的猪血清腹腔注射的方法建立肝纤维化大鼠模型，观察化浊解毒调肝方对肝纤维化大鼠血清中透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)水平和病理形态学的影响；化浊解毒调肝方对肝纤维化大鼠肝组织转化生长因子-β1(transforming growth factor-betal-1,TGF-βi)表达的影响；化浊解毒调肝方对肝纤维化大鼠肝组织Smad3蛋白表达的影响；从而探讨化浊解毒调肝法治疗本病的作用机制，为该法的临床应用提供理论依据。
　　 方法：清洁级Wistar大鼠50只，雄性，体重200～220g。适应性喂养一周后随机分为正常对照组、模型对照组、秋水仙碱治疗组（简称西药治疗组）、化浊解毒调肝方低剂量组(HZD)、化浊解毒调肝方高剂量组(HZG)，每组10只。各组均普通颗粒饲料喂养，自由饮水和进食，分笼饲养于22±2℃，湿度70％±5％清洁级动物实验室内。除正常对照组外，其余40只均采用未灭活的猪血清腹腔注射，每次0.5ml/只，固定时间为周一、周五上午9点，连续8周。造模成功后HZD组给予含1.5g/ml生药水煎剂灌胃，HZG组给予含3.0g/ml生药水煎剂灌胃；秋水仙碱组给予0.154g/kg·d灌胃，均至12周末。正常对照组与模型组给予0.9％生理盐水(10ml/kg)，日1次灌胃。12周末采用腹主动脉取血，分离血清，用放射免疫分析法测定各组大鼠干预后血清中HA、PCⅢ水平。取大鼠肝组织，采用苏木精-伊红染色观察肝组织病理形态学的变化。采用免疫组化检测大鼠肝组织TGF-β1蛋白的表达；采用免疫印迹(Western-immunoblotting)测定大鼠肝组织中Smad3蛋白的表达。数据用均数±标准差（(?)±s）表示，运用SPSS13.0统计软件处理。两个样本均数比较采用t检验，多个样本均数比较行完全随机设计单因素方差分析。
　　 结果：
　　 1一般情况：造模组1只大鼠死亡。正常对照组大鼠食欲佳，被毛光滑，精神状态好，活泼好动，体重逐渐增加。模型对照组大鼠精神萎靡、皮毛杂乱，黯淡无光泽、进食较正常组少、尿黄，有的大鼠鼻有出血，体重较前有所增加，但不如正常组增加显著。西药及中药治疗各组大鼠进食、营养、活动等尚可，体重逐渐增加，与正常组差别不显著。
　　 2化浊解毒调肝方对肝纤维化大鼠肝脏病理形态学的影响
　　 肉眼观察，正常组大鼠肝脏质软，略呈深红色，新鲜，表面光滑，无任何斑点，突起，边缘锐圆。模型组大鼠肝脏肿大明显，质地硬，颜色暗红，表而粗糙不平，有的可见颗粒样凸起，边缘钝。西药及中药治疗组大鼠肝脏肿大不明显，质较脆，表面较光滑，颜色略为暗红，表面偶有细沙粒状增生。光镜下，正常组肝小叶排列整齐，肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，无变性坏死，纤维组织只在中央静脉周围、汇管区周围有少量表达，含量极少。模型组肝小叶结构破坏，肝细胞变性、坏死伴中性粒细胞及淋巴细胞浸润，纤维组织大量增生，个别动物可见假小叶形成。秋水仙碱组与中药治疗各组肝脏损伤程度均较模型组轻，但秋水仙碱组与中药治疗各组之间病理形态无明显差别。
　　 3化浊解毒调肝方对肝纤维化大鼠血清HA、PCⅢ水平的影响
　　 与正常对照组相比，模型组大鼠血清HA、PCⅢ水平升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型对照组相比，12周末，各药物干预组大鼠血清HA、PCⅢ水平下降，有显著差异(P＜0.01)，秋水仙碱组、HZD组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）：HZG组与秋水仙碱组比较HA、PCⅢ水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 4化浊解毒调肝方对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1蛋白表达的影响
　　 正常组大鼠肝组织见少许TGF-β1阳性表达细胞，表现为不均匀的棕黄色颗粒状物。模型组大鼠肝组织中表达的阳性细胞比例显著高于正常组，与正常对照组相比，模型组大鼠肝组织TGF-β1蛋白表达增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型对照组相比，各药物干预组大鼠肝组织TGF-β1蛋白表达下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，且秋水仙碱组、HZD组之间TGF-β1蛋白表达无显著性差异（P＞0.05）；HZG组与秋水仙碱组比较TGF-β1蛋白表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　 5化浊解毒调肝方对肝纤维化大鼠肝组织Smad3蛋白表达的影响
　　 与正常对照组相比，模型对照组大鼠肝组织Smad3蛋白的表达量明显增强(P＜0.01)。化浊解毒调肝方各剂量组及秋水仙碱组与模型组相比Smad3蛋白的表达量均有下降，差异显著(P＜0.01)，HZD组与秋水仙碱组Smad3蛋白的表达量无显著性差异（P＞0.05），HZG与秋水仙碱组比较Smad3蛋白表达量降低，差异显著(P＜0.01)。
　　 结论：
　　 1化浊解毒调肝方能够改善肝纤维化大鼠的一般状况，且能够减轻肝细胞的损伤，减少胶原纤维的生成，从而改善肝组织病理。
　　 2化浊解毒调肝方能显著降低大鼠血清HA、PCⅢ型胶原含量，减少细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的生成，进一步抑制肝纤维化的形成。
　　 3化浊解毒调肝方能显著抑制大鼠肝组织TGF-β1和Smad3蛋白的表达，从而抑制肝纤维化大鼠肝脏中TGF-β/Smad信号传导通路的激活，减少大鼠肝脏细胞外基质的沉积，发挥其抗肝纤维化生物学作用。因此，以浊毒立论治疗肝纤维化具有实用性和可行性。

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化浊解毒调肝方对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1及Smad3表达影响的研究

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材料与方法

结果

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附表

讨论

结论

参考文献

综述 肝纤维化发病机制研究概况

参考文献

致谢

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