大花旋覆花内酯抑制HT-29结肠癌细胞株增殖及其机制研究

摘要

大花旋覆花内酯(ABL)是从欧亚旋覆花中提取的活性单体,具有抗炎和抑制血管平滑肌细胞增殖及新生内膜形成的功效,对乳腺癌、卵巢癌等肿瘤细胞株具有促凋亡作用。但ABL是否对结肠癌具有抑制作用尚不清楚。基于炎症是导致结肠癌发生发展的病理机制之一,本研究观察了ABL对HT-29结肠癌细胞株增殖和细胞周期的干预作用,并对其分子机制进行了探讨,为ABL在结肠癌治疗方面的应用提供了新的实验依据。
　　 方法和结果:
　　 1 ABL抑制HT-29细胞增殖
　　 将处于对数生长期的HT-29细胞接种于96孔板中,分别加入不同浓度ABL作用24 h后,用MTT法检测细胞增殖活性。结果显示,随着ABL浓度增加,HT-29细胞增殖活力不断下降,ABL的抗增殖作用具有剂量依赖性。与对照组相比,不同浓度ABL(0、50、100、150、200μmol/L)处理的HT-29细胞的增殖活力分别下降了21％、38％、49％和61％。
　　 在相同处理条件下,用细胞计数检测增殖活性,发现随着ABL浓度的增加,HT-29细胞数量不断降低,与对照组相比,分别减少了40％、52％、64％、76％和84％,与MTT分析结果一致,表明ABL能够剂量依赖性地抑制HT-29细胞的增殖。
　　 2 ABL对HT-29细胞周期的阻滞作用
　　 将ABL处理后的HT-29细胞制备成单细胞悬液,预冷的70％乙醇4℃固定过夜。加荧光染料后,过滤,用流式细胞仪检测细胞周期分布情况。结果显示,不同浓度ABL(50、100、150、200μmol/L)作用HT-29细胞24h后,可使处于S期的细胞数显著减少,而G0/G1期的细胞数增加,较对照组分别增加了3％、12％、19％和24％,表明ABL能够剂量依赖性地抑制HT-29细胞周期进程。
　　 3 ABL抑制HT-29细胞cyclinE和CDK4的表达,上调p21的表达用不同浓度ABL(0、50、100、150、200μmol/L)处理HT-29细胞24h后,用Western blot检测细胞周期相关蛋白的表达情况。结果显示,ABL可剂量依赖性地抑制cyclinE和CDK4的表达(P＜0.05),与此同时,p21的表达量逐渐升高,分别是对照组的1.16、1.43、1.53和1.59倍,提示ABL阻滞HT-29细胞周期进程与抑制cyclinE、CDK4表达及上调p21表达有关。
　　 4 ABL诱导HT-29细胞KLF4的表达
　　 Krüppel样因子4(Krüppel-like factor,KLF4)是一种含锌指结构的转录因子家族成员,主要参与调节细胞发育、分化、增殖和凋亡等过程,在胃肠道上皮细胞中含量丰富,在结肠癌的病理发生过程中发挥重要作用。Western blot结果显示,ABL可诱导HT-29细胞表达KLF4,与未处理的对照细胞比较,ABL处理24h后,KLF4表达水平分别是对照组的1.04、1.19、1.25和1.56倍。细胞免疫荧光染色结果显示,KLF4主要存在于HT-29细胞胞浆中,给予ABL(200μmol/L)刺激24h后,胞浆中KLF4含量明显增多。
　　 5 KLF4抑制HT-29细胞增殖
　　 为了确定ABL诱导KLF4表达与其抑制增殖之间的关系及药理意义,进而用重组腺病毒pAd-KLF4感染细胞48h进行MTT分析。结果显示,KLF4的过表达能够抑制HT-29细胞增殖,其抑制效应与感染病毒量(0、20、30、40和50μl/ml)呈正相关,提示JLF4参与介导ABL的抗增殖效应。
　　 6 KLF4抑制HT-29细胞中cyclinE和CDK4的表达,上调p21的表达
　　 为了揭示KLF4介导ABL抗增殖的机制,本研究观察了过表达KLF4对细胞周期相关蛋白表达的影响,Western blot分析发现与对照组相比,过表达KLF4的细胞中cyclinE和CDK4表达分别下降了51％和40％,而p21的表达水平是升高的。这些数据表明,过表达KLF4可引发与ABL相似的抗肿瘤效应,表明ABL是通过激活KLF4而阻滞细胞周期进程和抑制HT-29细胞增殖的。
　　 结论:
　　 1 ABL剂量依赖性地抑制HT-29细胞的增殖活性。
　　 2 ABL通过下调CDK4和cyclinE,上调p21使HT-29细胞的周期进程停滞于G0/G1期。
　　 3 ABL对HT-29细胞增殖的抑制作用与其激活KLF4的表达有关。

目录

文摘

英文文摘

第一部分 大花旋覆花内酯抑制HT-29结肠癌细胞株增殖及其机制研究

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

参考文献

第二部分 河北地区人群基质金属蛋白酶-2基因多态性与冠心病的相关性

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

参考文献

综述 细胞周期调控与肿瘤的研究进展

致谢

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