补肾壮骨中药对颌骨牵张成骨影响的机制探讨

摘要

目的：
　　 牵张成骨(distraction of osteogenesis,DO)作为活体骨组织工程的一种重要形式,为矫治各种先天及后天获得性畸形或缺损提供了重要手段。作为内源性组织工程技术,该方法与传统外科技术相比,具有诸多优点,如操作简单、术时短、创伤小、避免植骨及供区并发症、软组织可同期得到扩张。但是,由于DO的疗程相对较长,且有时会出现纤维性愈合、骨愈合不良、甚至骨不连等并发症,这些问题使得牵张成骨术的临床应用在一定程度上受到了限制。目前,许多方法被尝试用于促进牵张骨痂形成,缩短DO固定期,这些方法包括应用低频超声波、直流电或电磁场刺激、高压氧治疗、系统应用生长激素、以及局部应用生长因子、骨形成蛋白等。部分方法获得了一定的效果,然而所有上述手段均未获得广泛的临床应用。
　　 中医中药在医学的某些领域已显示出其独特、不可替代的作用和地位。中医中药能加速骨折的愈合,早已被临床证实。祖国医学在促进新骨形成、骨折愈合方面积累了大量经验。随着各种研究方法的介入,其治疗骨折的部分机制,目前已经阐明。在促进牵张成骨方面,在我们以往的研究中,已观察到补肾壮骨中药可以促进下颌骨牵张成骨的作用,补肾壮骨中药如何促进成骨,通过什么途径促进牵张成骨,目前还是未知。一些研究表明,传统中药可促进成骨细胞分化和增殖,可通过调节成骨基因、细胞因子促进骨折的愈合。因此,借鉴在治疗骨折等方面的成功经验,中医中药在缩短牵张成骨疗程方面必能发挥巨大作用,使得牵张成骨更加完善,手术并发症更少,患者更容易接受,因此有着广阔的应用前景。
　　 本研究首先应用补肾壮骨中药含药血清作用于体外培养的犬骨髓间充质干细胞(marrow stem cells,MSCs),观察中药对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化增殖的影响,同时也检测中药对成骨细胞碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)、骨保护素(osteocalcin,OPG)和细胞核因子κΒ受体活化因子配基(receptor activator of nuclear factorκΒ ligand,RANKL)等成骨的作用,探讨补肾壮骨中药对牵张成骨骨改建的作用机理;本研究将补肾壮骨中药应用于犬下颌骨牵张成骨,采用组织形态学、骨组织计量学及骨钙素(osteocalcin,OCN)mRNA的表达,观察下颌骨牵张成骨过程中补肾壮骨中药对成骨质量和骨钙素的影响。本研究拟从细胞水平和分子水平初步探讨补肾壮骨中药促进骨再生和加速骨愈合的机制,为补肾壮骨中药在DO中的临床应用提供理论依据。
　　 方法
　　 1补肾壮骨中药对犬骨髓干细胞成骨分化增殖的影响
　　 (1)MSCs原代培养、诱导培养及成骨活性的鉴定
　　 2只Beagle犬由胫骨获取骨髓,经Ficoll分离液进行梯度离心,MSCs经含胎牛血清的DMEM培养,传代后在培养液加入矿化诱导液(β-甘油磷酸钠,维生素C和地塞米松)促使其向成骨细胞分化,I型胶原蛋白免疫组化鉴定成骨细胞,银染色和茜素红染色鉴定钙结节。
　　 (2)实验分组及含药血清的制备
　　 实验分为含药血清组(A组)、无药血清组(B组)和胎牛血清组(C组)。含药血清组的血清来自补肾壮骨中药经煎制后,按体表面积折算等效剂量,2只Beagle犬连续喂服7天后经股动脉采血制备而成。无药血清组的血清来自等剂量生理盐水2只Beagle犬喂服7天后经股动脉采血制备而成。胎牛血清组的血清直接购买。
　　 (3)含药血清对MSCs分化生长的影响
　　 分别将第3代MSCs在含药血清(A组)、无药血清(B组)和胎牛血清(C组)的诱导矿化液+DMEM中培养。通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察MSCs分化生长的情况。
　　 (4)成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性的检测
　　 分别将第3代MSCs在含有含药血清(A组)、无药血清(B组)和胎牛血清(C组)的诱导矿化液+DMEM中培养。检测成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性。
　　 2补肾壮骨中药血清对成骨细胞OPG、RANKL mRNA表达的影响
　　 将第3代MSCs在含有含药血清(A组)、无药血清(B组)和胎牛血清(C组)的诱导矿化DMEM中培养。采用原位杂交的方法检测成骨细胞OPG和RANKL rnRNA的表达情况。
　　 3颌骨牵张成骨过程中补肾壮骨中药对成骨质量和骨钙素的影响
　　 选用16只Beagle犬随机分为中药组和对照组,所有动物行右侧下颌骨劈开后植入常规组合式骨牵张器,经7天延迟后,以0.5mm/12h的牵张速度,连续10天。中药组动物自牵张器植入术后第一天口服补肾壮骨中药至实验结束。分别于固定1周、2周、3周、4周后每组处死2只Beagle犬,留取标本后进行组织学观察、骨组织计量学分析及骨钙素的检测。
　　 结论
　　 1补肾壮骨中药能明显促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化增殖,提高成骨细胞的活性。
　　 2补肾壮骨中药可以调节成骨细胞分泌OPG、RANKL的功能,从而降低破骨细胞的活力,促进成骨过程,提高骨密度。
　　 3补肾壮骨中药在体内能有效地加速下颌骨牵张过程中新生骨质的生成与成熟。
　　 4补肾壮骨中药在分子水平和细胞水平上可以调节成骨的功能,保护已形成的骨组织,促进牵张成骨中骨的再生并加速骨愈合。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写

引言

第一部分 补肾壮骨中药对犬骨髓干细胞成骨分化增殖的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 补肾壮骨中药血清对犬成骨细胞OPG、RANKL mRNA表达的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 颌骨牵张成骨过程中补肾壮骨中药对成骨质量和骨钙素的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

全文小结

综述一 牵张成骨促进因素的研究进展

综述二 中药在骨愈合中的作用

致谢

个人简历