老年性痴呆脑微血管发病机制及通心络干预研究

摘要

目的:本研究在中医络病理论指导下,对老年性痴呆(AD)脑微血管发病机制及其在脑神经元损伤中的作用进行探讨,同时阐明依据络病理论建立的复方制剂一通心络(TXL)对AD脑微血管损伤的治疗优势以及其通过保护脑微血管实现保护脑神经元的作用途径,为本药临床治疗AD提供有力的实验依据。
　　 方法:
　　 本研究分为以下四部分内容:
　　 1.AD模型认知和记忆功能减退及TXL干预研究
　　 采用SAMP8小鼠作为研究对象,实验分为SAMR1空白对照组,SAMP8组、TXL(高、中、低)三个剂量组,石杉碱甲(SSJJ)组,共6个组,每组20只小鼠,小鼠给药量均为10ml/kg体重,灌胃给药,每日一次,连续90日,SAMR1组给予相同体积溶剂。实验结束后,观察各组小鼠一般情况、认知记忆功能、脑神经元损伤、脑皮层β淀粉样蛋白(Aβ)的沉积情况。
　　 2.AD模型脑微血管损伤及TXL干预研究
　　 本研究继续采用SAMP8小鼠作为研究对象,仍以SAMR1为对照,继第一部分实验证明了小鼠脑皮层Aβ沉积后,采用免疫组化方法观察各组小鼠脑微血管数目改变、内皮功能损伤情况、管周炎症因子的表达改变。
　　 3.Aβ诱导脑微血管内皮细胞(HBMEC)的损伤及TXL干预研究
　　 本研究采用细胞实验,分为空白组:HBMEC用10％FBS的DMEM培养基培养30h;模型组:HBMEC用10％FBS的DMEM培养基培养6h后,加入终浓度为20μmol/L Aβ1-42作用24h诱导细胞损伤;TXL组:HBMEC用10％FBS的DMEM培养基培养并分别加入终浓度为100、200、400ug/ml的TXL预处理6h后加入终浓度为20μmol/LAβ1-42作用24 h诱导细胞损伤。SSJJ组:HBMEC用10％FBS的DMEM培养基培养并加入终浓度为2μmol/L的SSJJ预处理6h后加入终浓度为20μmol/l Aβ1-42作用24h诱导细胞损伤。实验结束,倒置显微镜下观察细胞形态改变,SRB检测细胞的活性,硝酸酶还原法检测各组NO水平、ELISA检测各组细胞上清液中VEGF、IL-1β、IL-6、TNF-α水平;westernblot检测eNOS、NF-κB、HIF-1α、VEGF蛋白表达;RealtimePCR检测VEGFmRNA的表达。
　　 4.Aβ损伤脑微血管内皮细胞对脑神经元影响及TXL干预研究
　　 本研究采用原代培养脑神经元的方法,分为正常神经元组(空白组)、正常HBMEC上清液+神经元组(正常组)、Aβ损伤HBMEC上清液+神经元组(模型组)、Aβ损伤神经元组(Aβ损伤组)、TXL干预HBMEC上清液+Aβ+神经元组(TXL组),SSJJ干预HBMEC上清液+AD+神经元组(SSJJ组),共六个实验组,空白组加入100％无血清DMEM培养液,Aβ损伤组加入终浓度为10μmol/lAβ,其余各组均加入50％内皮细胞上清液和50％无血清DMEM培养液,将细胞置于温度37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养12h。实验结束后倒置显微镜下观察细胞的形态改变、HE染色观察细胞的形态改变、免疫荧光显微镜下观察细胞坏死和凋亡、MTT检测各组脑神经元的活性、流式细胞仪检测细胞凋亡率,westernblot检测凋亡蛋白酶Caspase-3、凋亡蛋白bax、bcl-2表达,realtimePCR检测baxmRNA、bcl-2mRNA表达。
　　 结论:
　　 1.首先运用中医络病理论探讨AD病机及治疗,脑之络脉分为运行经气为主的气络与运行血液为主的脉络,共同成为维持脑神活动的物质基础,基于气血相关的络病理论特色,AD虽病在气络,但亦不能忽视脉络结构与功能异常对其影响,基于精、气、神之间相互转化关系,指出元气亏虚、气络损伤是AD重要病机,气虚运血无力,脉络瘀阻,脉络末端供血供气、津血互换、营养代谢失常,亦可加重气络损伤,引起脑神失用,成为AD发病的病理基础,益气活血通络是AD的有效治法。
　　 2.基于中医脉络与西医中、小血管及微循环解剖形态相关性,吸取西医学关于AD微血管发病机制的最新进展,突破以往把AD单纯理解为神经变性性疾病的观念,从微血管损伤探讨AD的发病机制,结果显示快速老化型模型小鼠脑部微血管出现结构与功能损伤:脑皮层ET-1表达升高、NO分泌降低,微血管数目明显减少,管周炎性因子显著增加;离体细胞研究结果显示Aβ不仅可以引起HBMEC结构与功能损伤,Aβ与内皮细胞共孵育的上清液还可明显诱导脑神经元调亡,这不仅为西医学AD微血管发病机制假说提供了实验依据,也丰富了气血相关脉络学说的科学内涵。
　　 3.本研究结果显示,TXL可明显改善快速老化型小鼠记忆与认知功能,显著保护其脑微血管结构与功能;通过减轻Aβ所致脑微血管内皮细胞损伤有效减少脑神经元凋亡,初步揭示了TXL治疗AD微血管保护机制,为其在临床治疗AD提供了实验依据,也佐证了络病理论在AD中的指导价值。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写

引言

第一部分 老年性痴呆模型记忆和认知功能减退及通心络干预研究

前言

材料与方法

结果

附图、附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 老年性痴呆模型脑微血管损伤及通心络干预研究

前言

材料与方法

结果

附图、附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 Aβ诱导脑微血管内皮细胞损伤及通心络干预研究

前言

材料与方法

结果

附图、附表

讨论

小结

参考文献

第四部分 Aβ损伤脑微血管内皮细胞对脑神经元的影响及通心络干预研究

前言

材料与方法

结果

附图、附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述一 阿尔茨海默病中的脑微血管发病机制

综述二 从脑络论治老年性痴呆的研究进展

致谢

个人简历