毒毛旋花子苷原引起海马神经元细胞内钙变化机制研究

摘要

目的：Na+，K+-ATP酶（NKA）是一类广泛存在于真核生物细胞膜中的跨膜蛋白，在跨膜转运中维持Na+、K+的离子梯度，这种梯度对调节渗透压的平衡、静息电位的水平和生电性细胞（组织）如神经和肌肉的兴奋性具有重要的作用。强心类甾醇(CTS)是一类与Na+，K+-ATP酶特异性结合的化学物质，可在许多生理和病理条件下调节Na+，K+-ATP酶。在脑缺血、缺氧、中毒等病理条件下，Na+，K+-ATP酶的活性降低，Na+，K+-ATP酶被抑制，导致细胞内[Ca2+]i升高，从而引起细胞的损伤，故NKA是参与神经元损伤的机制之一，本研究主要选取对缺血、缺氧敏感的海马神经元，研究Na+，K+-ATP酶抑制剂毒毛旋花子苷原(Strophanthin，Str)对神经元细胞内钙的影响，并分析其作用机制。
　　 方法：①海马神经元的原代培养：取出生24小时内的乳鼠，断头，取脑，放入冰浴的D-Hanks液中，分离海马，剪成约1mm3小块，加入4～5倍组织块体积的0.125％的胰蛋白酶，37℃，消化10分钟，种植液冲洗3次后，用火焰刨光的玻璃吸管吹打制成细胞悬液，用种植培养液将细胞浓度调至1～2×106/ml。将细胞悬液种于预先铺好多聚赖氨酸的24孔细胞培养板中，3～5小时后给细胞补液。24小时后，全量换成饲养液，以后每3天换1次液，培养至7-14天用于实验。②激光共聚焦扫描显微镜测定海马神经元[Ca2+]i的变化：Fluo-420μmol/L37℃孵育神经元40min后，激发波长488nm，发射波长530nm，对细胞XYT平面进行扫描，间隔时间为10秒，连续扫描30分钟，[Ca2+]i变化通过给药前后荧光强度比值R表示(R=Ft/F0)。
　　 结果：1神经元的形态学观察接种后1～2小时海马神经元开始贴壁，细胞呈圆形或椭圆形，3天后，多数细胞从胞体长出数个突起，在7～10天开始成熟，胞体逐渐长至30～40μm，晕光明显，胞核和核仁清晰可见，突起变粗、变长并且有分支，14天后神经细胞生长最为丰满，胞体呈圆形或多角形，四周晕光明显。Fluo-4负载后，可在共聚焦显微镜下观察到海马神经元细胞胞浆内的绿色荧光。
　　 2Str对海马神经元细胞内钙的影响
　　 用含有不同浓度的Str（10-10、10-8、10-6、10-5和10-3mol/L）的HBSS灌流海马神经元，实验结果表明，给药前海马神经元的平均荧光强度为60-110，给予不同浓度的Str后，海马神经元平均荧光强度明显增加，其荧光强度分别是给药前荧光强度的109.4％、127.0％、172.7％、198％和274.1％，且呈剂量依赖性，从而提示Str可部分或全部抑制Na+，K+-ATP酶的活性，Str浓度越大，其抑制作用越强，升高海马神经元[Ca2+]i的作用越大。
　　 3谷氨酸释放对Str诱导的海马神经元细胞内钙升高的影响
　　 实验选用Str的浓度为10-8mol/L和10-5mol/L，10-8mol/LStr可抑制高亲合力Na+，K+-ATP酶a2和α3亚基的活性，10-5mol/LStr可抑制低亲合力Na+，K+-ATP酶ai亚基的活性。用含有NMDA受体阻断剂D-APV(50μM)和AMPA/Kainate受体阻断剂CNQX（10μM）的HBSS灌流海马神经元，二者对神经元[Ca2+]i均无明显影响(n=52，p＞0.05)。灌流给予Str+D-APV(50μM)和Str+CNQX(10μM)后，低浓度的Str(10-8mol/L)引起Ca2+的荧光强度变化的比值是1.317±0.01和1.314±0.017，与对照组相比无明显统计学意义(p＞0.05)；高浓度的Str(10-5mol/L)引起Ca2+的荧光强度变化的比值是1.925士0.071和1.910士0.031，与对照组相比也无统计学意义(p＞0.05)，从而提示海马神经元谷氨酸的释放对Str诱导[Ca2+]i的升高无明显影响。
　　 4细胞外钙对Str诱导的海马神经元细胞内钙升高的影响
　　 海马神经元用正常的HBSS灌流5分钟后，将灌流液换成含钙离子螯合剂EGTA1mM的无钙生理盐溶液，海马神经元[Ca2+]i无明显变化(p＞0.05)，5分钟后在灌流液中分别加入高浓度的Str（10-5mol/L）和低浓度的Str(10-8mol/L)，低浓度的Str(10-8 mol/L)引起Ca2+的荧光强度变化的比值是1.063士0.005(p＜0.01)，高浓度的Str(10-5mol/L)引起Ca2+的荧光强度变化的比值是1.099士0.018(p＜0.01)，与对照相比二者均可使海马神经元[Ca2+]i明显降低，从而提示细胞外钙内流是Str诱导[Ca2+]i的升高参与机制之一。为进一步证实细胞外钙对Str诱导的海马神经元细胞内钙升高的影响，用含有电压依赖性钙通道阻滞剂Nimodipine（50μM）的HBSS灌流海马神经元，结果表明，低浓度的Str（10-8mol/L）引起Ca2+的荧光强度变化的比值是1.060士0.041，高浓度的Str(10-5mol/L)引起Ca2+的荧光强度变化的比值是1.056士0.022，与对照相比二者均可使海马神经元[Ca2+]i明显降低，从而进一步提示Str诱导细胞[Ca2+]i的升高与细胞外钙的内流有关。5细胞内钙释放对Str诱导的海马神经元细胞内钙升高的影响
　　 用含有IP3受体阻断剂2-APB（50μmol/L）的HBSS灌流海马神经元，低浓度的Str(10-8mol/L)引起Ca2+荧光强度变化的比值是1.315士0.0237，与对照组相比无显著性差异(p＞0.05)，提示低浓度Str引起[Ca2+]i升高与细胞内钙的释放无关；而高浓度的Str(10-5mol/L)引起Ca2+的荧光强度变化的比值是1.640士0.045(p＜0.01)，与对照相比可使海马神经元[Ca2+]i明显降低，提示细胞内钙释放参与了高浓度Str(10-5mol/L)引起[Ca2+]i升高。
　　 6 PKA和PKC信号转导通路与Str诱导的海马神经元细胞内钙升高的关系
　　 在灌流液加入中PKC信号转导通路阻断剂CHE(10μmol/L)，低浓度的Str(10-8mol/L)引起Ca2+的荧光强度变化的比值是1.333±0.049，高浓度的Str(10-5mol/L)引起Ca2+的荧光强度变化的比值是1.853士0.024，与对照组相比二者均无显著性意义(p＞0.05)，提示Str引起[Ca2+]i升高与PKC信号转导途径无关。在灌流液加入中PKA信号转导通路阻断剂H89(1μM)，低浓度的Str（10-8mol/L）引起Ca2+的荧光强度变化的比值是1.245±0.029(p＞0.05)，高浓度的Str(10-5mol/L)引起Ca2+的荧光强度变化的比值是1.675±0.047(p＜0.01)，高浓度Str可使海马神经元[Ca2+]i明显降低，提示PKA信号转导途径与高浓度Str诱导细胞[Ca2+】i的升高有关。
　　 结论：Str可剂量依赖性增加大鼠海马神经元细胞[Ca2+】i的升高；谷氨酸受体与Str诱导海马神经元细胞[Ca2+】i无明显相关性；细胞外钙的内流参与Str诱导细胞[Ca2+]i的升高；细胞内钙可通过IP3受体参与高浓度Str(10-5mol/L)引起[Ca2+]i升高；Str引起[Ca2+]i升高与PKC信号转导途径无关，高浓度Str可通过PKA信号转导途径参与Str诱导细胞[Ca2+]i的升高；Src-MAPK信号转导通路参与Str诱导的海马神经元[Ca2+]i升高；Str引起[Ca2+]i升高与钠通道无关；高浓度的Str(10-5mol/L)引起[Ca2+]i升高可能与Na+-Ca2+交换体激活有关。

目录

文摘

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毒毛旋花子苷原引起海马神经元细胞内钙变化机制研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 Na+，K+-ATP酶信号转导功能在[Ca2+]i调控中的作用

参考文献

致谢

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