细丝蛋白A调控表皮生长因子受体活性在乳腺癌发病中的作用

摘要

目的：乳腺癌是严重威胁女性健康的第一位恶性肿瘤。
　　 表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）家族包括erbB-1/EGFR、erbB-2/HER2/neu、erbB-3和erbB-4四大成员，属于Ⅰ型酪氨酸激酶受体，酪氨酸磷酸化可使受体活化，控制着细胞的增殖、分化、移动和存活，受体的表达失调与肿瘤的发生相关。
　　 细丝蛋白A（FilaminA，FLNa），是细胞内一种肌动蛋白结合蛋白，同时又是脚手架蛋白，在细胞浆内广泛分布，也可以跨膜分布或转位至细胞核。
　　 许多研究证实FLNa在恶性肿瘤细胞的表达增多。如肺癌细胞内FLNa的表达上调，与肺癌的迁徙、粘附和侵袭相关；前列腺癌细胞的胞浆内FLNa表达较正常前列腺组织显著增高，且有转移的前列腺癌FLNa的表达高于无转移者；乳腺癌细胞内也存在FLNa高表达。
　　 为此，我们拟利用人乳腺癌细胞系，通过转染FLNa的siRNA降低FLNa表达、转染FLNa全长基因增加FLNa的表达后，观察EGFR的磷酸化水平及与EGFR磷酸化的相关的信号转导分子的变化；经免疫共沉淀（co-Immunoprecipitation，IP）证实FLNa与EGFR分子间的相互关系；利用MTT检测FLNa的表达对乳腺癌细胞增殖的影响。从组织、细胞和分子水平综合分析FLNa对EGFR磷酸化的调控，探讨FLNa调控EGFR磷酸化在乳腺癌发病中的作用，为有效治疗乳腺癌提供新靶点。
　　 第一部分细丝蛋白A在浸润性乳腺癌组织中的表达及与临床病理特征的相关性方法：采用链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶（SP）免疫组织化学方法和流式细胞分析技术，检测46例分化程度不同的浸润性乳腺癌细胞中FLNa和增殖细胞核抗原（pro-liferatingcellnuclearantigen，PCNA）的表达情况，以正常乳腺组织或乳腺良性增生为阴性对照。
　　 1.FLNa在乳腺癌组织中的表达免疫组化结果：FLNa在正常乳腺上皮细胞的胞浆内少量表达（Fig.1-1）；FLNa在浸润性乳腺癌细胞阳性表达的程度较强，且随组织分化程度的降低而增高（Fig.1-2～4、Fable1-1），差异有统计学意义（P<0.05）；有淋巴结转移乳腺癌细胞的FLNa的表达明显强于无转移组（Table1-1），差异有统计学意义（P<0.05）。FLNa在浸润性乳腺癌细胞中的表达与组织学分型无关。
　　 流式细胞检测结果：FLNa在正常乳腺组织的表达量较少；在低分化乳腺癌细胞中FLNa的表达（1.22±0.13）明显高于中高分化的乳腺癌细胞（1.10±0.11），差异有统计学意义（P<0.05），见Fig.1-6、Table1-2。无淋巴结转移者（1.21±0.11）明显高于有淋巴结转移者（1.10±0.10），差异有统计学意义（P<0.05），见Table1-2。FLNa在浸润性乳腺癌细胞中的表达与组织学分型无关。
　　 2.PCNA在乳腺癌组织中的表达免疫组化结果：PCNA在浸润性乳腺癌细胞核呈阳性表达，PCNA的表达随乳腺癌分化程度的降低而增强，在低分化浸润性乳腺癌细胞的表达呈强阳性，见Figl.1-5。
　　 流式细胞检测结果：低分化浸润性乳腺癌细胞中PCNA的表达（1.65±0.22）明显高于中高分化乳腺癌（1.35±0.15），差异有统计学意义（P<0.05），无淋巴结转移的乳腺癌细胞PCNA的表达（1.42±0.15）明显低于有淋巴结转移者（1.56±0.16），差异有统计学意义（P<0.05），见Fig.1-7、Table1-3。PCNA的表达与FLNa呈正相关（P<0.05）。
　　 第二部分FLNa对乳腺癌细胞表皮生长因子受体活化的影响方法：
　　 1.沉默FLNa的表达对乳腺癌细胞EGFR活化的影响用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养乳腺癌MDA-MB-231细胞。
　　 2.FLNa过表达对乳腺癌细胞EGFR活化的影响细胞培养
　　 3.免疫共沉淀证实FLNa对乳腺癌细胞EGFR的活化影响细胞培养
　　 结果：
　　 1.沉默FLNa的表达对乳腺癌细胞EGFR活化的影响1.1FLNa蛋白的表达：FLNa-siRNA转染组FLNa的表达（1.40±0.10、1.27±0.06）较HK对照组（3.97±0.29、3.33±0.06）明显减少，差异有统计学意义（均P<0.01），见Fig.2-1、Table2-1。
　　 1.2EGFR蛋白磷酸化水平：EGF刺激5min、10min后，FLNa-siRNA转染组的EGFR磷酸化水平（0.73±0.01、0.37±0.05）明显低于HK对照组（1.08±0.01、1.30±0.06），差异有统计学意义（均P<0.01），见Fig.2-2、Table2-2。
　　 1.3ERK磷酸化水平：EGF刺激5min、10min后，FLNa的siRNA转染组ERK磷酸化水平（0.17±0.00、0.12±40.04）明显低于HK对照组（0.32±0.02、0.54±0.04），差异有统计学意义（均P<0.01），见Fig.2-3、Table2-3。
　　 2.FLNa过表达对乳腺癌细胞EGFR活化的影响2.1FLNa的表达：FLNa-full质粒转染组FLNa的表达（5.93±0.38、6.07±0.32）明显高于空质粒pcDNA3.1对照组组（4.50±0.20、4.60±0.17），差异有统计学意义（均P<0.01），见Fig.2-4、Table2-4。
　　 2.2EGFR蛋白磷酸化水平：EGF刺激5min、10min后，FLNa-full质粒转染组EGFR的磷酸化水平（1.53±0.11、0.86±0.14）明显高于空质粒pcDNA3.1对照组（0.574±0.01、0.444±0.02），差异有统计学意义（分别P<0.01，P<0.05），见Fig.2-5、Table2-5。
　　 2.3ERK磷酸化水平：EGF刺激5min、10min后，FLNa-full质粒转染组ERK的磷酸化水平（1.834±0.07、1.06±0.07）明显高于空质粒pcDNA3.1对照组（0.744±0.01、0.594±0.03），差异有统计学意义（均P<0.01），见Fig.2-6、Table2-6。
　　 3.免疫共沉淀证实FLNa对乳腺癌细胞EGFR活化的影响3.1FLNa-siRNA转染后FLNa的表达：FLNa-siRNA转染组FLNa的表达（3.53±1.08、4.33±1.33）较HK对照组（7.234±2.20、7.534±1.86）组明显减少，差异有统计学意义（均P<0.01）。见Fig.2-7、Table2-7。
　　 3.2经抗EGFR抗体免疫沉淀后的EGFR磷酸化的水平：EGF刺激10min后，FLNa-siRNA转染组的EGFR磷酸化水平（1.09±0.09）明显低于HK对照组（2.32±0.22），差异有显著性（P<0.01）。见Fig.2-8、Table2-8。
　　 3.3经抗酪氨酸磷酸化4G10抗体免疫沉淀后EGFR的表达：EGF刺激10min时，FLNa-siRNA转染组的EGFR表达（0.42±0.01）明显低于HK对照组（1.07±0.01），差异有显著性（P<0.01），见Fig.2-9、Table2-9。
　　 第三部分细丝蛋白A对乳腺癌细胞增殖的影响方法：细胞培养见第二部分的方法1。用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液调细胞浓度为9×103/ml，按100μL/孔体积接种于96孔板。实验分组：FLNa-siRNA转染组和HK对照组；FLNa-full质粒转染组和空质粒pcDNA3.1对照组。分别用不同浓度的EGF（4nM、20nM、100nM）刺激过夜，用MTT法检测细胞的增殖水平。
　　 结果：
　　 1.FLNa沉默后MDA-MB-231细胞增殖水平：在4nM、20nM、100nM浓度的EGF刺激下，FLNa-siRNA转染组细胞的增殖水平随刺激浓度的增加而增高，FLNa沉默后细胞的增殖水平（1.284±0.09、1.46±0.02、1.58±0.06）均低于对照组（1.55±0.12、1.62±0.06、1.68±0.12），差异有显著性（p<0.01），见Fig.3-1、Table3-1。
　　 2.FLNa过表达后MDA-MB-231的细胞增殖水平：在4nM、20nM、100nM浓度的EGF刺激下，FLNa-full质粒转染组细胞的增殖水平随刺激浓度的增加而增高，但FLNa-full质粒转染组细胞的增殖水平（1.14±0.08、1.28±0.11、1.51±0.03）高于对照组（1.09±0.17、1.21±0.17、1.25±0.05），差异有显著性（P<0.01），见Fig.3-2、Fable3-2。
　　 结论：
　　 1.FLNa在正常乳腺组织少量表达；FLNa的表达随浸润性乳腺癌分化程度的降低而增高，且与淋巴结转移有关；FLNa的表达与乳腺癌细胞的增殖能力呈正相关。
　　 2.FLNa的表达可调控乳腺癌细胞EGFR的磷酸化，磷酸化的EGFR又通过MAPK.增殖信号传导通路活化ERK，影响乳腺癌细胞的增殖。
　　 3.沉默FLNa的表达导致乳腺癌细胞的增殖水平降低；FLNa的过表达则使乳腺癌细胞的增殖水平升高，表明FLNa可通过调控EGFR的活化影响乳腺癌的发生和发展。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写

引言

第一部分 细丝蛋白A在浸润性乳腺癌组织中的表达及与临床病理特征的相关性

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部 分细丝蛋白A对乳腺癌细胞表皮生长因子受体活化的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 细丝蛋白A对乳腺癌细胞增殖的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

综述一 细丝蛋白A与肿瘤

参考文献

综述二 乳腺癌分子调控机制研究的新进展

参考文献

致谢

个人简历