化瘀泄浊方对肾间质纤维化实验大鼠整合素连接激酶的影响

摘要

目的：终末期肾脏病(end-stage renal disease， ESRD)的主要病理特征为肾纤维化，包括肾小球硬化及肾间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis， TIF)。研究表明，慢性肾脏病患者肾间质纤维化的严重程度较肾小球病变更为重要。肾间质纤维化主要表现为细胞外基质(extracellular matrix ECM)的大量积聚和间质肌成纤维细胞(Myofibroblast， MyoF)的增生。而肾小管上皮细胞转分化(renal tubular epithelial to mesenchymal transition， EMT)在TIF发生发展中具有重要作用。转化生长因子β1(transforming growth factor，TGF-β1)是目前所公认的导致肾脏纤维化重要因子，它能通过多种途径参与EMT。在TGF-β1诱导的EMT过程中整合素连接激酶(integrin linked kinase， ILK)起重要作用。研究提示TGFβ1刺激呈时间和浓度依赖性诱导肾小管上皮细胞特异性表达ILK，同时ILK在TGF-β1/Smad信号转导途径介导的EMT过程中扮演重要的角色，最终导致了肾间质纤维化的发生。
　　 化瘀泄浊方是我们在临床上用治慢性肾衰竭的常用方，取得了较好的临床疗效。同时前期的实验我们已经证实，化瘀泄浊方能够抑制肾间质纤维化大鼠增殖细胞核抗原的表达，抑制肾小管上皮细胞转分化，并能够通过调节TGFβ1/Smad信号通路发挥对肾间质纤维化的拮抗作用。如前所述，ILK可能因为参与TGF-β1/Smad信号通路和激活下游因子从而参与EMT的关键步骤，是EMT过程中的一个重要调节者，在肾间质纤维化的发生发展过程中有重要作用。因此本研究进一步探讨化瘀泄浊方对肾间质纤维化大鼠ILK的影响，为进一步探讨肾间质纤维化发生、发展的机理，探讨化瘀泄浊方多途径、多靶点拮抗肾间质纤维化的治疗作用寻找实验依据。
　　 方法：选用雌性、健康SD大鼠50只，体重（180±10）g，清洁级。普通饲料适应性喂养一周，检测尿糖、尿红细胞和尿蛋白均为阴性，随机分为假手术组、模型组、化瘀泄浊方组、阿魏酸哌嗪分散片组、缬沙坦组，每组10只。除假手术组外其余各组均行左侧输尿管结扎术。手术前1日开始给药，化瘀泄浊方组大鼠经口灌服化瘀泄浊方5.7g/(kg·d)；阿魏酸哌嗪分散片组大鼠经口灌服阿魏酸哌嗪分散片6.7mg/(kg·d)；缬沙坦组大鼠经口灌服缬沙坦5.3mg/(kg·d)；假手术组和模型组予灌服同等量生理盐水。给药至实验结束前一天。全部大鼠于实验第21日全部杀检，摘取左侧肾脏光镜下观察病理形态学变化，免疫组织化学法检测肾组织ILK和Ⅲ型胶原(collagenⅢ，ColⅢ)表达，RT--PCR检测肾组织ILKmRNA的表达，所有数据均用均数±标准差(Mean±S)表示，采用单因素方差分析对实验结果进行统计学分析，数据统计分析应用SPSS统计软件完成。
　　 结果：
　　 1.肾脏病理形态学观察（见Fig1，5-14，Table1）：
　　 肾组织行HE及Masson染色，结果显示：模型组于肾间质可见大量炎细胞的浸润和纤维组织的增生，肾小管严重萎缩，肾小球数量减少。其它各治疗组间质的炎细胞浸润以及纤维组织增生较模型组减少，肾小管萎缩程度较模型组轻，肾小球数量无明显改变。
　　 2.ColⅢ的表达、分布及半定量分析结果（见Fig2，15-19，Table1）：
　　 主要表达于肾间质。假手术组大鼠表达很弱，其余各组ColⅢ的表达显著增强。与假手术组相比，模型组和各治疗组ColⅢ的表达显著性增强，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，化瘀泄浊方组、阿魏酸哌嗪分散片组、缬沙坦组ColⅢ的表达减弱，差异有统计学意义（P＜0.05），其中，化瘀泄浊方组ColⅢ的表达弱于阿魏酸哌嗪分散片组（P＜0.05），其他各组间ColⅢ的表达均无明显差异（P＞0.05）。
　　 3.ILK蛋白的表达、分布及半定量分析结果（见Fig3，20-24，Table2）：
　　 ILK主要表达于肾小管上皮细胞胞浆中，假手术组ILK在肾小管上皮细胞中表达很弱。与假手术组比较，模型组和各治疗组ILK的表达显著增强，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组相比，化瘀泄浊方组、阿魏酸哌嗪分散片组、缬沙坦组ILK的表达减弱，差异有统计学意义(P＜0.05)，其中，化瘀泄浊方组ILK的表达优于阿魏酸哌嗪分散片组，差异有统计学意义（P＜0.05），其他各组间均无明显差异（P＞0.05）。2.5ILK mRNA的表达及半定量分析结果（见Fig4，25-26，Table2）ILK RT-PCR半定量分析结果显示，与假手术组比较，模型组和各治疗组ILK的表达显著增强，差异有统计学意义(P＜0.01)；与模型组相比，化瘀泄浊方组、阿魏酸哌嗪分散片组、缬沙坦组ILK的表达减弱，差异有统计学意义（P＜0.05），其中，化瘀泄浊方组ILK的表达弱于阿魏酸哌嗪分散片组，差异有统计学意义（P＜0.05），其他各组间均无明显差异(P＞0，05)。
　　 结论：
　　 1.化瘀泄浊方组肾组织的病理损害减轻，ECM积聚减少，证实化瘀泄浊方能够延缓肾间质纤维化的进程。
　　 2.化瘀泄浊方可能通过抑制肾组织ILK蛋白及其mRNA的表达，从而减少肾小管上皮细胞转分化，使病变肾组织ECM合成减少，发挥对肾间质纤维化的治疗作用。