自体骨髓间充质干细胞移植对急性心肌梗死家兔Ryanodine受体和其稳定蛋白表达的影响

摘要

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),心脏移植修复急性心肌梗死后心肌组织是目前医学研究热点。动物实验和临床研究发现。BMSCs心脏移植能够抑制急性心肌梗死后的心室重构,改善心脏功能,但是移植到体内的BMSCs具体存活情况、分化成心肌细胞的程度和分化的心肌细胞与原心肌组织的连接关系等问题目前并不完全清楚,BMSCs移植治疗缺血性心衰是通过移植细胞分化为新生心肌细胞还是移植细胞旁分泌作用及其确切机制这些问题也不十分明了。Ryanodine受体(Ryanodine receptor,RyR2)是肌浆网上主要钙离子释放通道,在心肌的兴奋-收缩藕联过程中具有重要作用。目前研究还认为RyR2的稳定蛋白FKBP12.6在调控RyR2通道的作用中最为重要。当FKBP12.6与RyR2结合时,RyR2能稳定的处于关闭状态;当FKBP12.6与RyR2解离时,RyR2通道就处于开放状态,肌浆网内的钙离子就释放入胞浆。此外,FKBP12.6还参与调节相邻的RyR2同步开放和关闭。研究发现,心衰时,心肌细胞RyR2和FKBP12.6表达下降,RyR2结构和功能发生异常引发RyR2钙渗漏增加,使肌浆网内钙贮存减少,收缩期肌浆网释放钙减少,导致心肌收缩力减弱,心功能降低。另外,RyR2钙释放通道数量减少,还进一步减少心肌收缩期肌浆网钙释放量,加重心肌收缩力降低,使心衰加重。实时荧光定量PCR是目前国内分子生物研究中的新方法,比半定量PCR检测结果准确性高。因此,我们实验通过BMSCs心脏移植修复急性心肌梗死后心肌,应用实时荧光定量PCR方法检测心肌RyR2和FKBP12.6 mRNA,研究BMSCs心脏移植治疗缺血性心力衰竭的机制。
　　 目的:通过密度梯度离心法和贴壁法获得BMSCs,观察自体BMSCs心脏移植对心肌梗死家兔心肌Ryanodine受体和其稳定蛋白(FKBP12.6)表达的影响及经5-氮胞苷诱导后体外培养4周的BMSCs的超微结构,探讨BMSCs心脏移植治疗缺血性心力衰竭的机制。
　　 方法:将30只新西兰白兔随机分为三组:对照组(只开胸但不结扎冠状动脉前降支)、AMI组(开胸结扎冠状动脉前降支)和BMSCs组(开胸结扎冠状动脉前降支加BMSCs移植)。采用结扎冠状动脉前降支的方法制备急性心肌梗死动物模型。利用密度梯度离心法和贴壁法获得BMSCs,经5-氮胞苷诱导后,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)标记。当家兔AMI模型制备后的第10天时,在BMSCs组,将600μl DAPI标记的1.0×107个BMSCs悬液用微量注射器分别按4点直接注入梗死灶边缘区域;在AMI组,注射等体积的无血清DMEM液。在移植后4周时,利用实时荧光定量RT-PCR法检测梗死边缘区RyR2和FKBP12.6 mRN,A表达。采用超声观察术前及术后左心室射血分数(INEF)的变化。利用倒置显微镜观察BMSCs的生长形态;用荧光显微镜观察DAPI标记的移植细胞在体内的存活情况;利用透射电镜观察经5-氮胞苷诱导后体外培养4周的BMSCs超微结构。采用SPSS13.0统计软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差(x-±s)表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,均数比较采用LSD检验,相关性采用Pearson相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果:通过密度梯度离心法和贴壁法获得BMSCs形态均一,纯度较高。BMSCs经5-氮胞苷诱导后细胞形态变长,体积增大,增殖速度减慢,大约14天左右能见到趋于融合的多核细胞结构。透射电镜观察经5-氮胞苷诱导4周的BMSCs为BMSCs和肌细胞特点间的过渡类型细胞,可见到微肌丝样结构,但是未发现肌小节样结构。心脏超声检查,在AMI前,三组间家兔的左室血分数(LVEF)差异无统计学意义(P＞0.05)。在AMI后7天时,对照组、AMI组和BMSCs组的LVEF分别为67.88±3.91％;53.63±3.38％;51.50±3.51％(F=48.836,P=0.0001),AMI组和BMSCs组的LVEF值比对照组降低,差别有显著性统计学意义。AMI组和BMSCs组的组间LVEF值差异无统计学意义。在BMSCs心脏移植后4周时,与AMI组比较,BMSCs组的LVEF有显著改善(F=42.769,P=0.0001)。用荧光显微镜可观察到BMSCs移植组心肌内有DAPI标记的阳性细胞。GAPDH、RyR2和FKBP12.6的实时荧光定量PCR扩增曲线和溶解曲线说明心肌组织中均有GAPDH、RyR2和FKBP12.6 mRNA的表达。与对照组比较,AMI组梗死边缘区心肌的RyR2 mRNA和FKBP12.6 mRNA表达量减少,分别减少1.97倍(P＜0.05)和减少4.41倍(P＜0.05);与AMI组比较,BMSCs组RvR2 mRNA增加1.81倍(P＜0.05),FKBP12.6mRNA增加2.75倍(P＜0.05),LVEF与RyR2和FKBP12.6mRNA均具有正相关性,相关系数r分别为0.824和0.778,P均＜0.05,有统计学意义,决定系数R2分别为0.679和0.606。
　　 结论:经5-氮胞苷诱导后体外培养4周的BMSCs有向心肌细胞分化的趋势。BMSCs心脏移植心功能的改善与心肌组织FKBP12.6和RyR2呈正相关,心肌FKBPl2.6和RyR2表达下调是心功能降低的影响因素之一。通过旁分泌作用使心肌RyR2和FKBP12.6表达增加改善心功能是BMSCs心脏移植治疗缺血性心力衰竭的机制之一。

目录

文摘

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前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 Ryanodine受体在心力衰竭和心律失常中的作用

致谢

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