双甲氧姜黄素对人突变TDP-43转染NSC34细胞系中线粒体功能障碍的保护作用

摘要

目的：肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis， ALS)是一致命的神经变性性疾病，其特点是进行性的运动神经元的丢失。主要表现为上、下运动神经元受累所导致的肌肉萎缩和瘫痪，最终多因延髓麻痹或肺部感染而死亡。绝大部分病人是散发的，仅10％的患者是显性遗传的家族型。大约20％的家族性肌萎缩侧索硬化症是由编码Cu/Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD1)的基因突变引起的。在过去的10余年里，人突变的Cu/Zn超氧化物歧化酶转基因鼠的建立为家族性肌萎缩侧索硬化症的病理机制研究开辟了广阔的研究领域。但时至今日，对SOD1突变转基因鼠的机理和治疗的研究成果并没有广泛应用到人类，而且SOD1生化方面的改变在散发性ALS中的作用备受质问。因此，近来有些研究者开始怀疑SOD1突变转基因鼠的价值所在。最近，一个43千道尔顿的TAR-DNA绑定蛋白(TDP-43)被发现存在于肌萎缩侧索硬化和泛素阳性额颞叶变性病人中包涵体里。而且，这个蛋白的病理改变也存在于很多散发性ALS病人中。因此对TDP-43致病机理的研究将非常有益于理解散发性和家族性ALS。TDP-43是由1号染色体上TARDBP基因编码的414个氨基酸组成的核蛋白。TDP-43的主要功能是调节mRNA的代谢，包括转录的抑制，外显子的遗漏，RNA的剪切。
　　 线粒体损伤出现在各种神经变性病中。在ALS病人和各种SOD1相关家族ALS实验模型中，研究发现线粒体在形态和功能上均有异常。例如早期对G37R突变SOD1转基因鼠的研究发现线粒体肿胀和空泡变在疾病症状前期就表现出来。而且，在疾病早期运动神经元尚未死亡时，细胞内线粒体已经大量的变性退化了。另外，在对散发性ALS病人的肌肉和脊髓研究中发现线粒体呼吸链复合酶Ⅰ和Ⅳ的活性是降低的。这些均说明线粒体异常是ALS致病的重要因素之一。然而，绝大部分有关线粒体功能异常的研究结果来源于SOD1转基因鼠模型的研究。因此将这些研究扩展到其它ALS模型以确定线粒体功能异常是ALS的共同结果就具有重要的意义。为了进一步阐述线粒体功能障碍对ALS致病的作用，以及筛选针对线粒体的治疗药物，我们在细胞水平对人TDP-43转染NSC-34细胞进行了线粒体方面的研究，同时观察了双甲氧姜黄素的治疗效果。
　　 方法：
　　 1.细胞培养及人TDP-43转染NSC-34细胞系的建立
　　 NSC-34细胞是具有很多运动神经元特性的杂交细胞系。这些细胞通常生长在温度37℃、含5％二氧化碳的大气环境中，培养液是含10％灭活胎牛血清和青链霉素的高糖DMEM配方。我们按照试剂生产商的操作规范，用LipofectamineTM2000转染试剂将含有人正常(WT)，M337V，或Q331K突变TDP-43 pCI-neo质粒以及空pCI-neo质粒分别转染至NSC-34细胞。然后用G-418抗生素筛选细胞，将耐G-418抗生素的各细胞系分离、培养、传代、冻存。同时用western blot检测转染效率。转染了空质粒、野生型、Q331K或M337V突变TDP-43的NSC-34细胞生长在含0.5毫克/毫升G-418培养液中（配方同上）进行传代。
　　 2.治疗药物和干预方案
　　 通过姜黄素的甲氧基化，双甲氧基姜黄素被合成。双甲氧姜黄素以15毫摩尔的浓度溶解到二甲替甲酰胺(DMF)中。对转染Q331K或M337V突变TDP-43的NSC-34细胞进行药物干预和疗效观察。治疗组接受15微摩尔终浓度的双甲氧姜黄素干预3天，对照组用二甲替甲酰胺干预3天。然后收集细胞进行各项指标的检测。
　　 3.蛋白免疫印迹
　　 收集细胞，根据试剂生产商操作规范用总蛋白提取试剂盒从细胞中提取总蛋白。采用BCA蛋白浓度测定法测定蛋白浓度。每个样本用50微克蛋白进行钠十二烷基的硫酸盐(SDS)聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳，然后将凝胶上蛋白转印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。这些包含有蛋白的PVDF膜与一抗在4℃下孵育过夜。次日再与结合有荧光染料的二抗孵育。最后用Odyssey红外图像扫描系统对PVDF膜进行扫描以确定某一蛋白的表达水平。
　　 4.电镜检测
　　 从培养瓶收集细胞，于4％戊二醛固定过夜，经磷酸缓冲液(PBS)冲洗后用1％娥酸后固定。然后样本经过系列脱水并包埋于812树脂中，包埋块经超微切片和染色后用透射电子显微镜观察细胞内线粒体形态的变化。
　　 5.线粒体膜电位的测定
　　 我们采用细胞流式术对线粒体膜电位进行测定。首先将转染空质粒，WT，M337V或Q331K突变TDP-43的四个细胞系分别收集到PBS中，离心后与罗丹明123在37℃环境下孵育30分钟。经PBS冲洗细胞两遍后立即用流式细胞仪检测细胞内罗丹明123荧光染料强度。表达空质粒的细胞系作为正常对照。每个样本至少分析1万个细胞。
　　 6.线粒体的提取
　　 为了分离线粒体，我们采用一种改良的氮气空化法。此方法能最大程度的减少细胞裂解和提取过程中对线粒体功能的损伤，因此可以保证线粒体功能测定的真实性。另外各细胞系均在同一代数被收集以确保相互之间的可比性。首先用线粒体提取液洗细胞一遍，然后收集到预冷的细胞破裂容器中，氮气加压到1500psi，持续15分钟，放气使容器腔内压力下降至800psi。从容器下端出口放出细胞悬液。先用600×g离心力离心细胞悬液10分钟以除去细胞碎片。收集上清液以17，000×g离心10分钟。弃上清剩下的沉淀便是粗制的线粒体部分。将沉淀再次悬浮于线粒体提取液里分装成每份100微升到EP离心管。在液氮里速冻后存于-80℃冰箱用以以后的实验。
　　 7.线粒体丙二醛测定
　　 线粒体丙二醛水平能够反映线粒体的脂质过氧化水平，因此可以间接反映线粒体内自由基水平。我们用硫代巴比土酸(TBARS)方法测定丙二醛水平。根据试剂生产厂商的说明，线粒体样本与试剂混合，置于95℃水浴箱中孵育40分钟，然后自来水冷却，在532nm波长下读取样本的吸光度。丙二醛含量表达为纳摩尔TBARS/毫克蛋白。
　　 8.线粒体呼吸链复合酶活性的测定
　　 采用分光光度计方法来测定各呼吸链复合酶的活性。我们用改良的Janssen等描述的方法来评估线粒体呼吸链复合酶Ⅰ的活性。同时要强调的是，在开始测定之前一定要将鱼藤酮加到另一比色皿中以允许鱼藤酮有时间结合到反应部位。复合酶Ⅱ的活性通过检测反应体系中二氯酚靛酚含量的变化速度来反映。复合酶Ⅲ催化细胞色素C由氧化型转化为还原型，550nm波长处吸收值的变化代表了所生成的还原型细胞色素C的含量。用表观一级速率常数代表复合酶Ⅲ的活性。复合酶Ⅳ催化还原型细胞色素C的氧化，其活性表达为一级速率常数。
　　 结果：
　　 1.稳定转染NSC-34细胞系的建立
　　 我们用免疫蛋白印迹法来检测细胞稳定转染的蛋白表达水平。所转染的TDP-43蛋白均带有HA标签，因此用抗HA抗体来检测细胞内外源性TDP-43表达情况。结果显示在转染WT，Q331K或M337V突变TDP-43的细胞中，均能检测到HA的表达，而且相对内源性TDP-43来说是一低水平的表达。转染空质粒的细胞内未检测到HA表达。
　　 2.人突变TDP-43对线粒体形态的影响以及双甲氧姜黄素的效果
　　 结果来源于两次独立的样本。在转染空质粒NSC34细胞中，线粒体的脊排列整齐；而在转染突变TDP-43的细胞中，线粒体脊间隙扩张甚至出现空泡变。经3天双甲氧姜黄素的干预后，线粒体的形态有一定程度改善。
　　 3.人突变TDP-43致线粒体复合酶Ⅰ的活性降低和双甲氧姜黄素的改善作用
　　 我们测定了各细胞系线粒体复合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的活性，结果发现人突变TDP-43仅造成复合酶Ⅰ活性的降低并具有统计学意义，且以Q331K突变TDP-43降低最明显，而复合酶Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的活性未发现明显改变。为说明复合酶Ⅰ活性的降低是否是复合酶Ⅰ蛋白合成障碍引起的，我们检测了复合酶Ⅰ亚单位NDUFB8的蛋白表达水平，结果未发现明显统计学差异，提示线粒体复合酶Ⅰ活性的降低是由于复合酶Ⅰ的功能障碍所致，而非复合酶Ⅰ蛋白合成障碍引起的。经双甲氧姜黄素干预后，复合酶Ⅰ的活性较对照组上升了两倍多。
　　 4.线粒体膜电位的变化及双甲氧姜黄素的效果
　　 人TDP-43转染到NSC-34细胞后引起具有统计学意义的线粒体膜电位的降低，并以Q331K突变TDP-43降低最明显，这与复合酶Ⅰ活性降低是一致的。使人兴奋的是双甲氧姜黄素能恢复降低的线粒体膜电位，较对照组升高大约两倍左右。
　　 5.解耦联蛋白2蛋白水平的改变及双甲氧姜黄素的影响
　　 解耦联蛋白2是细胞内一种保护性蛋白，它的上调可降低线粒体内自由基水平，减少自由基对线粒体的损伤。我们的结果显示人TDP-43转染到NSC-34细胞后引起明显的解耦联蛋白2的上调，用双甲氧姜黄素干预后解耦联蛋白2的水平又降至接近正常水平。这种变化说明该药物能降低人TDP-43对线粒体的损伤。
　　 6.线粒体内丙二醛水平
　　 线粒体丙二醛含量代表了线粒体脂质氧化水平，间接反映线粒体内自由基水平。奇怪的是我们的结果并没有发现在各细胞系存在线粒体丙二醛水平的差异。
　　 结论：
　　 1．人突变TDP-43在NSC-34细胞能引起线粒体功能障碍。这些异常体现在几个方面。(1)人突变TDP-43引起线粒体形态出现异常。(2)降低了线粒体复合酶Ⅰ的活性。(3)降低了线粒体膜电位。(4)上调了解耦联蛋白2的表达水平。
　　 2．双甲氧姜黄素在细胞水平对TDP-43所致的线粒体功能障碍具有保护作用。体现在(1)线粒体形态异常的改善，(2)恢复了复合酶Ⅰ的活性，(3)恢复了线粒体膜电位，(4)下调了解耦联蛋白2异常高水平。

目录

文摘

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英文缩写

双甲氧姜黄素对人突变TDP-43转染NSC34细胞系中线粒体功能障碍的保护作用

引言

第一部分 人TDP-43稳定转染NSC34细胞系的建立

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分 人TDP-43对NSC34细胞线粒体功能的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 双甲氧姜黄素对线粒体功能障碍的保护作用

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述 线粒体与肌萎缩侧索硬化

参考文献

致谢

个人简历