PPO基因沉默对人恶性黑素瘤细胞A375增殖影响的实验研究

摘要

目的:恶性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)是一类起源于神经嵴的黑素细胞恶性肿瘤,发病率占皮肤恶性肿瘤的第三位(6.8％~20％)[1],是皮肤科领域最常引起死亡的恶性肿瘤。恶性黑色素瘤的恶性程度高、发生转移早,预后严重,治疗的关键是早期诊断、正确分期;对于早期非侵袭性的病变,手术彻底清除病变为最佳治疗选择;对于晚期患者,主要治疗为化疗及免疫治疗等。化疗药物可单用或联合应用[2],但目前的治疗方法仍不理想,且免疫疗法仍处在试验阶段。
　　 PPO(proliferation and phosphorylation oncogene)基因是刘思源[3]等利用克隆筛选技术找到的一个新的癌基因,该基因位于1p36区,编号为KIAA0090,DNA长度约36000bp,eDNA长度6022bp。共有25个外显子,编码993个氨基酸。研究发现该基因在多种恶性肿瘤癌组织中都有高表达,与细胞增殖和磷酸化关系密切,能够使MAPK.通路中的MEK1/2和ERK2磷酸化,因此把该基因命名为PPO(poroliferation andphosphorylation oncogene)。
　　 RNA干扰技术是今年来发现的从基因水平治疗肿瘤的新方法。RNA干扰(RNA.interference RNAi)是一种由双链RNA(double-standedRNA,dsRNA)诱发的基因沉默(gene sileneing)。RNA干扰技术是近年来发现的从基因水平治疗肿瘤的新方法。某些恶性黑色素瘤演变后,对化疗诱导的细胞凋亡、抑制癌基因的表达产生抵抗。RNA干扰技术为治疗对化疗产生耐药性的恶性黑色素瘤开辟了新的途径。
　　 刘亚玲[4]等利用PPO基因的cDNA序列片段,免疫雌性BALB/c小鼠。取小鼠脾细胞进行体外培养,利用骨髓瘤细胞与脾细胞融合后,寻找杂交瘤抗体进行克隆化。单克隆抗体用免疫扩散的方法行Ig亚类测定。克隆化的杂交瘤细胞给小鼠腹腔注射,抽取腹水后使抗体纯化,制作完成了PPO抗体。并用免疫印迹法检测PPO基因在恶性黑色素瘤组织中表达情况,以及检测PPO抗体。结果显示,PPO蛋白印迹位于140×103附近,膜上无其他蛋白印迹,蛋白印迹清晰,表明PPO抗体具有很强的特异性,可以作为检测恶性肿瘤的一种特异性抗体此前该课题组已经进行了PPO基因在A375细胞中的表达研究,发现PPO基因在细胞水平同样存在过表达[5],但能否通过RNAi的方法沉默PPO基因及其表达,抑制MAPK通路中PPO基因相关蛋白的表达,从而在细胞水平抑制恶性黑色素瘤的生长增殖,有待进一步研究.
　　 方法:
　　 1细胞培养
　　 将A375细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基(含青霉素100U/ml,含链霉素100U/ml,PH7.2)中,置于37℃、饱和湿度、5％CO2的培养箱内常规传代培养。
　　 2倒置相差显微镜观察A375细胞细胞分化及形态。
　　 3荧光显微镜下观察不同MOI(病毒个数/细胞个数)=5,10,20,50,100时,腺病毒转染A375细胞的效率及细胞分化、形态变化。
　　 4取转染后48小时细胞做RT-PCR,观察A375细胞PPO的表达变化。
　　 5 MTT比色分析法检测MOI=50时,在转染后第1天、第3天、第5天、第7天对A375细胞增殖抑制的影响。
　　 6采用流式细胞分析术,Anexin-v-PI双染色检测MOI=50时,在转染后第1天、第3天、第5天、第7天A375细胞早期凋亡的变化,将实验分为阴性对照组(不加任何药物),空转录病毒组(加入HK),实验组(加入同等量PPO)
　　 7运用统计软件SPSS13.0对数据进行统计处理,采用单因素方差分析,以a=0.05为显著性差异标准。
　　 结果:
　　 1未经腺病毒转染处理过的人A375细胞呈梭形或多角形,贴壁生长,分布均匀,大小基本一致,增殖旺盛,核固缩现象少见。
　　 2转染24小时后MOI=5,10,20,50,100时转染效率分别为50％、67％,69％、70％、70％。MOI=50时转染效率达到最大且增大MOI值转染效率不再变化,故以下转染实验取MOI=50时转染后不同时间对细胞的影响。A375出现不同程度的皱缩、破裂,细胞生长状态不佳,有的细胞变狭长两端出现伪足,漂浮细胞增多,随时间延长,上述现象更加明显,而阴性对照组、空转录病毒组细胞生长旺盛,分布均匀,大小一致,仅有少数脱壁细胞。
　　 3转染A375细胞48小时后,用RT-PCR方法检测PPO基因mRNA表达,实验组较阴性对照组,空转录病毒组的mRNA表达强度减低,证明腺病毒已经成功转染A375细胞并部分沉默PPO基因。
　　 4 MTT比色分析法检测处理因素对人A375细胞增殖的影响。
　　 转染后第1天,第2天及第3天,阴性对照组,空转录病毒组,实验组间无显著性差异(p＞0.05)。转染后第5天,第7天阴性对照组与空转录病毒见无显著性差异(p＞0.05),实验组与阴性对照组,实验组与空转录病毒组见均有显著性差异(p＜0.05)。5流式细胞仪,Anexin-v-PI双染色检测MOI=50转染后不同时间各组对
　　 A375细胞早期凋亡率的变化与对照组有显著性差异(p＜0.05)
　　 结论:
　　 1 PPO腺病毒载体成功转染人A375恶性黑色素瘤细胞。
　　 2经腺病毒转染后,能下调人.A375恶性黑色素瘤细胞PPO基因mRNA的表达。
　　 3下调对PPO基因的表达对A375细胞生长有增殖抑制作用。
　　 4 PPO腺病毒载体转染人A375恶性黑色素瘤细胞能诱导A375细胞早期凋亡。

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前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 基因沉默治疗恶性肿瘤的研究进展

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