幽门螺杆菌对胃癌培养细胞A4GnT基因表达的诱导作用及调控位点研究

摘要

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)与胃炎、胃溃疡和胃癌的发生有密切的联系,虽然幽门螺杆菌的感染率可达到50％以上,但大多数感染者并未出现临床症状,因此推测人体自身可产生对幽门螺杆菌的天然防御能力。有研究表明,在胃黏膜的贲门腺、幽门腺、颈黏液腺、十二指肠Bruuner's腺等部位的细胞中存在一种α-1,4-N-乙酰葡糖胺转移酶(α-1,4-N-acetyglueosaminyltransferase,A4GnT),该酶能转移N-乙酰葡糖胺到具有核2分支O-聚糖的β半乳糖残基上形成α-1,4-N-乙酰葡糖胺末端。而在胃腺黏液中,在末端连接有α-1,4-N-乙酰葡糖胺的O-聚糖黏蛋白具有天然抗菌素的功能,该物质可抑制幽门螺杆菌细胞壁中的一种成分α-葡糖胆固醇的生物合成,从而抑制幽门螺杆菌的增殖、游动并使之变形。所以推测胃腺黏液细胞中的.A4GnT通过在胃腺黏液蛋白的O-聚糖上形成了α-1,4-N-乙酰葡糖胺,来阻隔幽门螺杆菌侵入深层胃黏膜,从而起到对胃黏膜的天然保护作用。因此,我们将幽门螺杆菌与胃癌培养细胞共培养后,通过RT-PCR.和免疫组织化学染色对胃癌细胞中A4GnT基因表达量的改变进行了研究,并且通过电泳迁移率改变分析对可能存在的调控位点进行了探讨。
　　 目的:在幽门螺杆菌的诱导作用下,使用RT-PCR的方法研究A4GnT基因在mRNA水平的变化;使用免疫组织化学染色的方法研究A4GnT基因蛋白表达水平的变化;并应用电泳迁移率改变分析探讨与幽门螺杆菌调控相关的A4GnT顺式作用元件与转录因子的结合,从而研究幽门螺杆菌诱导A4GnT基因表达改变的调控机制。
　　 方法:
　　 1细胞培养:将胃癌细胞株MKN45复苏后,培养于含有10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml,链霉素的RPMI1640培养基中,置于5％CO2浓度,37℃恒温和饱和湿度的培养箱中进行培养,用胰酶消化后以2×105个/ml细胞数传代,培养24h后用于实验。
　　 2细菌培养:将幽门螺杆菌标准菌株J99和SS1复苏后,接种于含有5％羊血、0.47μg/ml多黏菌素B、11μg/ml万古霉素和11μg/ml两性霉素B的哥伦比亚琼脂培养基,培养于37℃微需氧条件下3～5d后用于实验。
　　 3实验分组:幽门螺杆菌组:将浓度为1×106 CFU/ml的幽门螺杆菌标准株J99和SS1分别与MKN45细胞共培养6h后更换培养基继续培养至24h和48h。对照组:细胞内加入等量无幽门螺杆菌的培养基培养6h后更换培养基继续培养至24h和48h。
　　 424h后提取细胞RNA,使用RT-PCR方法检测各组A4GnT基因mRNA逆转录表达水平,通过1.5％琼脂糖凝胶进行电泳后,与内参照物β-actin进行比较,判断结果。
　　 548h后免疫组织化学染色法检测各组A4GnT蛋白表达水平,使用DAB进行显色后,每张盖玻片计数5000个细胞,计算阳性率后判断结果。
　　 624h后提取细胞核蛋白,使用EMSA检测各组A4GnT核转录因子表达水平,曝光于X光片上,判断结果。
　　 7检测结果的统计分析应用SPSS17.0统计软件。RT-PCR检测结果应用凝胶一蛋白分析系统进行相对定量分析,以均数±标准差((x)±s)表示,两组间比较用t检验;免疫组化染色结果以各组细胞阳性率表示,两组间比较用X2检验。显著性检验水准为ρ＜0.05。
　　 结果:
　　 1 RT-PCR结果:幽门螺杆菌J99作用于人胃癌细胞MKN45后24h,A4GnT RT-PCR产物表达量(0.6495+0.0129)与对照组(O.1241+0.0084)比较明显升高ρ＜0.05);幽门螺杆菌SS1作用于人胃癌细胞MKN45后24h,A4GnT RT-PCR.产物表达量(0.37754-0.0293)与对照组(O.1241+0.0084)比较明显升高(ρ＜0.05)。
　　 2免疫组织化学染色结果:免疫组化染色后,光镜下幽门螺杆菌J99组A4GnT阳性细胞数(22.7％)与对照组A4GnT阳性细胞数(4.5％)比较,有明显的增加,两组间的差异有统计学意义(ρ＜0.05);幽门螺杆菌SS1组A4GnT阳性细胞数(14.2％)与对照组A4GnT阳性细胞数(4.5％)比较,有明显的增加,两组间的差异有统计学意义(ρ＜0.05)。
　　 3 EMSA检测与A4GnT顺势作用元件相结合的核转录因子表达结果:幽门螺杆菌J99和SS1作用于人胃癌细胞MKN45后,启动子区Sp1/Sp3结合位点(-140bp～119bp)与Sp3结合量降低;幽门螺杆菌J99作用于人胃癌细胞MKN45后,核转录因子与A4GnT。基因中三种潜在的NF-κB位点结合量明显升高。
　　 结论:
　　 1幽门螺杆菌J99和SS1与胃癌细胞MKN45共培养后,A4GnT基因mRNA表达量升高。
　　 2幽门螺杆菌J99和SS1与胃癌细胞MKN45共培养后,A4GnT基因表达的蛋白量升高。
　　 3 A4GnT基因在幽门螺杆菌的作用下表达升高是通过转录水平的调控引起的,可能通过调节转录因子NFκB和Sp1/Sp3与A4GnT基因顺式作用元件的结合来完成的。

目录

文摘

英文文摘

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 a-1,4-N-乙酰葡糖胺转移酶的研究进展

致谢

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