FimH蛋白对尿路细胞TLR4及其相关细胞因子的表达和抗感染作用的影响

摘要

目的:尿路感染(urinary tract infection,UTI)是常见的感染性疾病,80％以上由尿路致病性大肠杆菌(UPEC)引起。FimH蛋白是UPECⅠ型菌毛的顶端蛋白,是细菌感染尿路细胞的关键因素,它能特异地与膀胱表皮细胞表面的甘露糖糖蛋白结合,诱导宿主细胞局部重排而直接介导UPEC的侵入,引起膀胱炎和反复发作的尿路感染(UTIs),目前己成为预防细菌性尿路感染的候选靶蛋白。用FimH蛋白免疫动物,可诱导高水平特异性FimH抗体(IgG和SIgA)的产生,并能与90％以上的表达有FimH的大肠杆菌发生交叉反应,对尿路感染具有一定的保护作用。我们以前的研究也得到了相似的结果。
　　 研究发现,FimH蛋白是TLR4的一种新的病原相关分子模式,能够直接与巨噬细胞表面的TLR4结合,通过MyD88依赖的信号通路的激活,促进TNF-α等细胞因子的产生,提高小鼠腹腔巨噬细胞的抗病毒活性。此外,FimH还可通过TLR4依赖的途径激活NK细胞,产生IFN-γ提高NK细胞抗病毒活性。可见FimH蛋白对固有性免疫也具有调节作用。TLR4也表达于尿路上皮细胞,参与尿路细胞的抗感染作用,且FimH蛋白对尿路细胞和TLR4的作用还未见研究报道。
　　 本课题旨在研究FimH蛋白对膀胱上皮细胞,肾小管内皮细胞TLR4表达和相关炎症因子的调节作用,研究FimH蛋白对尿路细胞的抗菌作用的影响,以及对小鼠膀胱感染模型中炎症反应强度的影响,为进一步研究FimH蛋白对尿路粘膜固有性免疫的调节作用提供实验依据。
　　 方法:
　　 1目的蛋白的纯化:将本室已构建的原核表达质粒pGEX-4T-2-fimH转染感受态E.coli BL-21,用IPTG诱导表达蛋白FimH,经SDS-PAGE鉴定后,纯化、定量;MTT法检测融合蛋白的细胞毒性;鲎变形细胞溶解物LPS试剂盒测定LPS含量。
　　 2将制备的FimH蛋白取不同浓度分别刺激膀胱上皮癌5637细胞株、肾小管癌上皮A498细胞株和巨噬细胞Thp-1,流式细胞仪检测细胞表面TLR4的表达变化,应用Real-Time PCR检测细胞因子IL-6、IL-8、TNF-αmRNA的表达变化。
　　 3不同浓度的FimH蛋白刺激5637细胞48小时,加入大肠杆菌U30共培养2h,洗去细胞外的U30菌,用0.2％的Triton-X100溶解细胞,溶解液稀释后用LB平板培养过夜,菌落计数,评价FimH蛋白对膀胱细胞抗菌作用的影响。
　　 4.将制备的FimH蛋白腹腔注射BALB/c小鼠,设空白对照组(注射生理盐水),100ug/只,每组15只,连续注射7天后取小鼠膀胱和肾组织,Real-time PCR检测IL-6,TNF-α等细胞因子,免疫组化观察组织TLR4表达。
　　 5用U30菌经尿道上行感染小鼠,制备成膀胱感染模型,将FimH蛋白腹腔注射感染小鼠,共三天,以生理盐水为对照,每组15只,Real-timePCR检Nd,鼠膀胱和肾组织IL-6,TNF-a等细胞因子mRNA的表达,膀胱HE染色观察FimH蛋白作用后膀胱组织炎症侵润程度。
　　 结果:
　　 1成功纯化目的蛋白FimH,蛋白定量浓度为166.5ug/ml,检测蛋白LPS含量为1030pg/ml,即FimH蛋白中内毒素含量为6.18pg/ug,参考文献报道当FimH蛋白溶液内为LPS4～7pg/ug时,LPS无活性作用。经MTT法检测证明当蛋白FimH浓度≤25ug/ml时对细胞无毒性。
　　 2流式细胞仪检测FimH作用于5637、A498和THP-1三种细胞48h后,细胞表面TLR4的表达水平均较空白对照组显著增高(P＜0.05)。
　　 3 FimH作用于膀胱癌上皮细胞株5637、肾小管癌上皮细胞株A498和巨噬细胞THP-124h后Real-time PCR检测显示:5637和A498的IL-6,IL-8 mRNA表达水平一致性增高,TNF-α,MyD88则无明显变化;THP-1细胞IL-6、TNF-α、MyD88 mRNA表达与空白对照组和LPS对照组比较均显著升高(P＜0.05)。
　　 4 U30细菌刺激低、中、高浓度FimH蛋白分别作用的5637细胞显示:与对照组细菌数(230±69)相比,FimH0.5μg/ml、2.Sμg/ml和12.5μg/ml浓度蛋白作用组内U30细菌数显著降低(P＜0.05),有统计学意义;其中中浓度(2.5μg/ml)FimH蛋白作用组5637细胞内细菌数(77±20)呈下降趋势最明显。
　　 5 FimH蛋白作用小鼠膀胱和肾IL-6,TNF-α mRNA表达水平显著增高(P＜0.01),且膀胱组织TNF-α mRNA表达明显高于肾组织;免疫组化显示FimH蛋白作用组小鼠膀胱、肾组织TLR4表达量均高于生理盐水对照组。
　　 6感染模型小鼠应用FimH蛋白后,膀胱和肾IL-6,TNF-α mRNA表达水平显著高于对照组(P＜0.05)。膀胱组织HE染色显示与生理盐水对照组比较FimH作用组膀胱组织炎细胞浸润减少,粘膜表面平滑、完整。
　　 结论:
　　 1尿路致病性大肠杆菌的FimH蛋白,能显著提高5637细胞、A498细胞和THP-1细胞表面TLR4的表达,在体内也能促进膀胱、肾脏细胞TLR4的表达。
　　 2 FimH蛋白能促进5637细胞和A498细胞IL-6,IL-8 mRNA表达增高,且可能是以MyD88非依赖途径。而FimH蛋白作用与THP-1细胞,显著促进IL-6和TNF-α mRNA的表达且以MyD88依赖途径。
　　 3 FimH蛋白能显著增强5637细胞对U30细菌的抵抗作用。
　　 4 FimH蛋白可刺激小鼠膀胱和肾组织的IL-6和TNF-α mRNA表达,且能降低尿路感染后的膀胱炎症反应的强度。

目录

文摘

英文文摘

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 尿路致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛FimH蛋白尿路感染和固有性免疫调节中的作用

致谢:

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