实验性脑出血大鼠下丘脑组织蛋白质组学研究

摘要

目的:脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是神经系统的常见疾病,它是指脑动脉、静脉或毛细血管破裂所致脑实质内的出血,占急性脑血管病的20％-30％,致残率和病死率均较高,严重危及人类的生命和身体健康。脑出血并发下丘脑植物神经功能紊乱近年来备受国内外研究者的关注,其发生严重影响了患者的预后。较常见的植物神经功能紊乱的症状包括应激性溃疡、中枢性高热以及水电解质紊乱等。应激性溃疡是急性卒中最严重的并发症之一,对其积极预防及治疗在一定程度上可以改善患者的预后。脑出血后合并中枢性高热则常常提示病情危重,死亡率大大增加。下丘脑作为整合中枢和垂体、脑干等其他部分发生纤维联系涉及神经内分泌、体温调节、摄食、饮水、睡眠觉醒周期及生殖等自主功能的调节。由此可见,直接对下丘脑组织进行研究必定会更加直观的揭示ICH后并发上述常见的植物神经功能紊乱的病理生理机制。
　　 蛋白质是基因功能活动的最终执行者,是生命现象复杂性和多样性的直接体现者。蛋白质组学技术的兴起是生命进入后基因组时代的标志。它是从整体的角度研究蛋白质的特征,包括蛋白质的表达水平、翻译后修饰、蛋白与蛋白之间的相互作用等,揭示蛋白质功能与细胞生命现象之间的规律。差异蛋白质组学则是分析不同生物体在不同时刻或者状态下蛋白质表达上的差异,为探索细胞分子机制及寻找治疗药物靶点提供了可能性的依据。
　　 本研究通过对大鼠脑出血模型的制作,对正常下丘脑组织和脑出血72小时下丘脑组织进行差异蛋白质组学研究,找出有差异表达的蛋白质,以期探寻脑出血后并发下丘脑植物神经功能紊乱的病理生理机制,为进一步筛选特异性功能相关蛋白和药物干预靶位提供线索。
　　 方法:
　　 1.制作大鼠脑出血模型,于72小时处死动物,取下丘脑组织。空白对照组取相应部位脑组织。2.提取下丘脑组织的总蛋白,利用双向电泳(2-DE)技术比较大鼠脑出血72小时下丘脑组织和正常对照组下丘脑组织蛋白的差异表达。第一向等电聚焦电泳、第二向垂直SDS-PAGE电泳后,以硝酸银或考马斯亮蓝R250染色。投射扫描双向电泳凝胶图,得到图谱后用:Image Master2D Elite软件进行图像分析。对感兴趣的蛋白点从凝胶上切下,胶内蛋白质酶解。应用基质辅助激光解析/电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF/TOF MS)技术结合数据库检索进行蛋白质功能鉴定及分析。3.以Western blot技术验证了两个蛋白(电压依赖性阴离子选择通道蛋白1和二氢嘧啶酶相关蛋白2)的表达变化。
　　 结果:成功制作大鼠脑出血模型,运用蛋白质组学技术,比较脑出血72小时组与正常对照组的下丘脑组织,发现29种蛋白的表达量发生了变化:上调蛋白14个,包括电压依赖性阴离子选择通道蛋白1,Rad GDP分解抑制剂a,谷氨酰胺合成酶,鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G分子亚基β-2,血影蛋白α链,二氢硫辛酸脱氢酶,4-氨基丁酸氨基转移酶,α-互联蛋白,细胞色素(b-c1)复合体亚基1,丙酮酸激酶同功酶M1/M2,泛素蛋白C末端水解酶L1,14-3-3蛋白E,神经丝轻链多肽,琥珀酸脱氢酶(泛醌)黄素蛋白亚基。下调蛋白15个,包括肌酸激酶B型,苹果酸酶,过氧化物酶1,髓鞘碱性蛋白S,磷酸甘油酸变位酶-1,果糖二磷酸醛缩酶C,磷酸丙糖异构酶,3-磷酸甘油醛脱氢酶,二氢嘧啶酶相关蛋白2,丙酮酸脱氢酶(E1)组成亚基β,N,N-二甲基精氨酸二甲氨水解酶,磷脂酰乙醇胺结合蛋白1,α-烯醇化酶,ATP合酶亚基α,谷氨酸脱氢酶1等。
　　 结论:1.获得了脑出血72小时下丘脑组织和正常空白对照组下丘脑组织的全蛋白表达双向电泳图谱。2.鉴定出的脑出血72小时和正常对照组的下丘脑组织差异表达蛋白涉及细胞骨架蛋白、能量代谢酶类、抗氧化作用的酶、细胞凋亡相关蛋白以及神经递质酶等方面,我们认为它们可能与脑出血后并发下丘脑植物神经功能紊乱的发病机制相关,为进一步筛选特异性功能相关蛋白和药物干预靶位奠定了基础。3.以Western blot技术验证了两个差异表达蛋白(电压依赖性阴离子选择通道蛋白1和二氢嘧啶酶相关蛋白2),为进一步研究此两种蛋白参与的功能网络调控奠定基础。

目录

文摘

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前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 神经系统疾病和下丘脑植物神经功能紊乱

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