体外心肌样微环境诱导P19细胞向心肌细胞分化

摘要

一般认为成熟的心肌细胞为终末分化细胞,无生长和繁殖能力,因心肌梗死而损伤的心肌组织也就不能得到修复,由此造成心肌细胞数量下降,是引起心力衰竭等心脏疾病的重要原因。目前细胞移植为病损心肌细胞的修复提供了一种全新的治疗方案。有学者提出用骨骼肌细胞代替心肌细胞,但是研究发现:移植骨骼肌细胞可能会使部分患者患上严重的心律不齐并导致患者的死亡。胚胎干细胞的成功分离,为坏死心肌细胞的修复带来了希望。胚胎干细胞是“全能”的细胞,可以分化为人体所有种类的细胞。因此,理论上讲,在适当的条件下,胚胎干细胞可以分化为心肌细胞。近年来,不少研究致力于探讨诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化的条件。目前认为,干细胞进入微环境后会对相应的各种物理或化学信号做出反应,即环境诱导分化。多种细胞的体内外分化研究表明,体内心肌环境或体外“心肌样”环境比单纯的化学物质诱导更为重要。鉴于此,本实验应用P19细胞与乳鼠心肌细胞进行直接接触培养或用“心肌样”环境条件培养P19细胞,运用形态学技术、分子生物学技术,研究P19细胞在心肌环境中的生长、分化状态,探讨环境因素对P19细胞分化的作用及分化机制,为P19细胞体内分化机制及细胞移植的研究奠定基础。
　　 一 P19细胞传代及悬浮培养
　　 P19细胞常规复苏传代培养,取传代4代以上的P19细胞,以5×105/mL,密度接种在铺有低熔点琼脂的培养皿中,培养4天,形成细胞聚集体EBs(embryonic bodies,EBs)。用倒置显微镜观察P19细胞生长分化情况,以及悬浮培养4天后形成EBs的情况。
　　 结果显示:P19细胞传代后约2h开始贴壁生长,细胞呈圆形,24h后长满瓶底的50％左右,细胞呈扁平不规则形,48h细胞生长密集。P19细胞在铺有低熔点琼脂培养基的培养皿中悬浮培养48h后,细胞聚集形成细胞团,较均匀规则,悬浮生长。至第4天形成球形EBs。
　　 二乳鼠心肌细胞的分离培养及鉴定
　　 取出生1-3天的SD大鼠乳鼠,75％酒精消毒皮肤,开胸取出心室肌组织剪成1mm3的小块,用胰酶和EDTA消化,直至组织消化完全,收集消化液过滤、离心、重悬后,通过差速贴壁一次和加入0.1mmol/LBrdU来纯化心肌细胞。48h后换去含BrdU的培养基,以后隔天换液,倒置显微镜观察细胞变化。培养3天后心肌细胞呈梭形、多角形等不规则形态,伸出突起相互连接交织成网,并出现成片同化搏动,频率多为60-120次/分。
　　 cTnT抗体免疫细胞化学染色显示:心肌细胞胞质中出现棕黄色丝状结构。心肌细胞纯度鉴定:乳鼠心肌细胞培养72h,cTnT阳性率为70％。
　　 三体外心肌微环境定向诱导P19细胞向心肌细胞分化
　　 1、P19细胞和乳鼠心肌细胞共培养
　　 用BrdU标记P19细胞,BrdU标记浓度为15μmol/L,标记时间为48h,免疫细胞化学结果显示:细胞核标记为棕黄色,阳性率为50％。
　　 将4×105/mL的乳鼠心肌细胞与1×103/mLP19细胞共培养7、10天,用cTnT抗体进行免疫细胞化学染色,结果显示:心肌细胞胞质中出现棕黄色丝状结构,部分P19细胞的细胞质、细胞核均呈棕黄色,表明部分P19细胞向心肌细胞分化,且随培养时间延长阳性细胞数增加。用WesternBlotting技术检测cTnT和connexin43(Cx43)结果显示:共培养组和单独培养乳鼠心肌细胞组结果比较(P＜0.01),有统计学意义。且随培养时间延长表达增高(P＜0.01),有统计学意义。提示共培养组中cTnT和Cx43的表达量均高于单独培养心肌细胞组,且增多的部分主要来自P19细胞。
　　 2、心肌细胞裂解液和心肌细胞条件培养液培养P19细胞
　　 P19细胞悬浮培养至第4天形成EBs,用心肌细胞裂解液和心肌细胞条件培养液各分别培养EBs至7、10天,完全培养基培养的EBs做为对照,Western Blotting结果显示:心肌细胞裂解液组和心肌细胞条件培养液组cTnT和Cx43的表达均高于对照组(P＜0.05),结果有统计学意义。且心肌细胞裂解液组cTnT和Cx43的表达高于心肌细胞条件培养液组(P＜0.05),结果有统计学意义。随培养时间延长表达增高(P＜0.01),有统计学意义。免疫细胞化学结果显示:Ebs边缘的部分细胞的细胞质中可见cTnT呈阳性表达。
　　 3、共培养组、心肌细胞裂解液组和心肌细胞条件培养液组免疫细胞化学cTnT阳性结果
　　 培养至第10天,P19细胞与乳鼠心肌细胞共培养组,P19细胞cTnT阳性高于心肌细胞条件培养液组和心肌细胞裂解液组(P＜0.05),且心肌细胞裂解液组高于心肌细胞条件培养液组(P＜0.05)。
　　 结论
　　 1、与心肌细胞共培养、心肌细胞条件培养液和心肌细胞裂解液三种培养方法,均可在体外模拟心肌微环境诱导P19细胞向心肌细胞定向分化,表达心肌细胞特异cTnT和Cx43,且表达量随培养时间延长而逐渐增高。
　　 2、共培养条件下,cTnT阳性的P19细胞数明显高于心肌细胞条件培养液组和心肌细胞裂解液组,且分化的P19细胞与心肌细胞相连并共同搏动,表明机械力的牵拉作用可有效促进P19细胞向心肌细胞分化。

目录

文摘

英文文摘

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 P19细胞心肌定向分化的方法及其机制

致谢

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