液态纳米组织工程骨对兔实验性股骨头缺血性坏死修复作用的实验研究

摘要

目的：股骨头坏死在骨科领域属于多见病、常见病，对髋关节具有非常大的破坏性和退行性改变，致残率高和病程长是其特点，对人民的健康危害严重。股骨头坏死治疗不当，约80％的患者在1～4年内可出现股骨头塌陷。一旦股骨头出现塌陷，患者的髋关节功能就意味着毁损。因此治疗的主要目的是防止股骨头塌陷，保存自体股骨头。由于股骨头坏死的发病机制还未完全明确，因此对股骨头坏死的治疗尚无有效的方法。目前有很多保髋手术方法，如带血管蒂的腓骨移植、髓芯减压、表面置换、血管束植入等，均取得一定的治疗效果，但没有一种技术是非常满意的。近年来有研究表明纳米羟基磷灰石/胶原(nano2hydroxyapatite/collagen，nHAC)的成分和微结构与天然骨非常相似，矿物相是含有碳酸根的羟基磷灰石，晶粒尺寸在纳米量级，结晶度低，矿物和Ⅰ型胶原蛋白基质均匀混合。自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植可诱导分化成骨细胞早已在体内外实验中得到证实。在动物模型上采用干细胞移植治疗股骨头坏死，亦取得良好效果。本实验试图用液态纳米组织工程骨(nHAC/BMSCs)修复股骨头骨缺损，以研究其对股骨头坏死区修复的效果，探索用液态纳米组织工程骨治疗股骨头坏死的新领域。
　　方法：1.实验前的准备工作及实验动物的分组：在做实验前一周饲养好实验动物，如果有疾病则淘汰，如果健康则做为实验动物，手术前一天给予实验动物禁食水。选好之24只成年新西兰大白兔，随机分为A、B两组，每组12只，A组为液态纳米组织工程骨(nHAC/BMSCs)移植组，B组为BMSCs联合自体松质骨移植组。术后2，4，6，8周A、B两组分别处死3只新西兰大白兔。2.BMSCs的取得、培育及混合载体：做实验前1周从新西兰大白兔髂后上嵴处抽取骨髓，把骨髓液种植于选好之6孔细胞培养板内，板内培养液为20％胎牛血清DMEM液，培养板置入细胞培养箱内，以密度为1×106/cm2传代，传至第3代。第3代细胞培养至传代密度时制成细胞悬液，A组种植在准备好的纳米材料(nHAC)上，制备成组织工程骨，在细胞培养箱内培养24小时，待手术时植入被实验动物股骨头坏死区。B组与明胶海绵颗粒混合，在细胞培养箱内培养24小时，手术时将BMSCs和明胶海绵混合物及自体松质骨颗粒一并植入实验动物股骨头坏死区。3.制备动物模型及实验方法：所有实验动物的两侧股骨头都做实验。实验动物采取俯卧位，麻醉药选硫喷妥钠注射液，麻醉时按40mg/kg的硫喷妥钠注入腹腔内。麻醉成功后消毒、铺无菌巾单。取双侧髋关节后侧入路，暴露双侧股骨头，把液氮棉团溥于股骨头处连续冷冻3分钟，股骨头坏死模型即制成。自然复温后用直径3.5mm钻头从股骨颈内后侧向股骨头内钻孔，钻入深度为4mm，不穿过关节软骨。A组钻孔后在坏死模型坏死区植入液态纳米组织工程骨(nHAC/BMSCs)，逐层缝合切口。B组钻孔后在坏死模型坏死区植入BMSCs+明胶海绵颗粒+自体松质骨颗粒，逐层缝合切口。4.HE染色：从10％福尔马林液中取出浸泡的股骨头标本，于股骨颈基底处锯开，把标本做好标记，用8％甲酸溶液把标本脱钙，共换液三次，脱钙时间为两周。脱水、透明、浸蜡、修块，做成5μm切片，水浴，铺片，烤片。最后做HE染色：熔蜡，酒精梯度水化，亚甲兰染色，酸化，返兰，伊红染色，再用酒精梯度脱水，透明。再用光学树脂封片。5.X线及组织学观察：通过X射线片观看股骨头标本钻孔区骨密度和骨小梁的改变状况。苏木精-伊红染色切片，光镜观看股骨头标本钻孔区细胞及骨小梁的改变状况。6.统计学方法：采用SPSS11.5统计学软件，分析股骨头标本缺损区新生成的骨小梁图像，对其面积百分比均值进行t检验分析。
　　结果：1.标本股骨头X线检查：A组2周时标本X线显示，钻孔区以外的骨小梁结构完整，钻孔区内在植入液态纳米组织工程骨(nHAC/BMSCs)的部位高密度影较明显。4周标本X线显示，钻孔区以外的骨质密度增加，但钻孔区以外的骨小梁结构完整，钻孔区内植入物密度有轻度减低。6周时标本X线显示，钻孔缺损区以外骨质密度增加，钻孔区以外的骨小梁结构紊乱，在钻孔区内所植液态纳米组织工程骨(nHAC/BMSCs)部分的密度略高，有骨小梁出现，钻孔区内所植物与钻孔区外界限模糊。第8周时标本X线显示，在股骨头钻孔缺损区以外的骨密度增加，骨小梁出现紊乱现象，并且有骨下囊样变。在实验股骨头钻孔区内植入物有部分骨密度接近正常，有骨小梁出现，钻孔区内植入物与钻孔区外界限模糊程度比6周时的标本加重。B组：2周时实验股骨头标本X线显示钻孔区以外骨质密度增加，骨小梁结构完整钻孔区内所植物的密度减低。4周时的标本显示实验股骨头标本钻孔区外骨质密度增加，骨小梁结构完整，在钻孔区内植入物密度增高，但与正常骨密度相比，还显略低。6周时的实验股骨头标本显示在钻孔区以外骨质密度有所增加，骨小梁出现紊乱现象，同时有软骨下囊样变性。在钻孔区内发现有稀疏骨小梁。8周时的标本显示，实验股骨头标本在钻孔区以外的骨质密度增加，骨小梁出现紊乱现象，并且出现软骨下囊样变性。在钻孔区内可发现有骨小梁，植入物密度接近正常，植入物与钻孔区界限表现模糊。总体而言A组实验股骨头缺损区内植入的液态纳米组织工程骨(nHAC/BMSCs)的密度由高逐渐降低最后接近正常骨小梁。B组实验股骨头的缺损区内植入的BMSCs+明胶海绵颗粒+自体松质骨颗粒，密度开始降低然后再升高，最后接近正常骨小梁结构。2.实验股骨头标本的组织学检查：A组实验动物的股骨头标本术后2周时，在实验股骨头标本的钻孔缺损区内发现缺损区边缘有较多的新生骨小梁及类骨质，缺损区内有大量的成骨细胞。4周时股骨头的缺损区内发现有类骨质填充及大量骨小梁形成。6周时实验股骨头缺损区内发现骨髓组织及较成熟的骨小梁。在第8周时发现股骨头缺损区内有大量骨髓组织及成熟的骨小梁。B组术后2周时，在钻孔区中心被炎症细胞充填，在钻孔区的边缘有较多的新生骨组织，在新生骨的内侧有一个成骨细胞层。4周时在实验股骨头标本的钻空区内有较多的新生骨小梁，但并未充满整个股骨头，有的有少量骨组织在标本钻孔区的中央，有的在钻孔区内未发现骨组织。6周时比4周时的情况是有血管出现，有骨髓组织，骨小梁较成熟。8周时实验股骨头钻孔区边缘被骨髓组织、骨小梁组织充满。
　　统计学分析：术后8周时，A、B两组实验动物股骨头缺损区内的骨小梁的面积百分比值分别是，A组是0.805516，B组是0.803966，通过统计学分析证明，具备方差齐性，总体无差别，两两比较P>0.05，无统计学意义。
　　结论：1.液态纳米组织工程骨(nHAC/BMSCs)有较为理想的诱导成骨能力，能有效地提高股骨头坏死的骨修复能力，有望成为股骨头坏死治疗的一种手段；2.液态纳米组织工程骨(nHAC/BMSCs)修复股骨头坏死效果等同于自体松质骨联合BMSCs。