体外冲击波对早期股骨头坏死区骨髓间充质干细胞破骨分化的影响及相关临床研究

摘要

股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是临床上有着较高发病率且呈进行性发展的疾病，并以因局部供血不足而引起的骨细胞的坏死为特征。股骨头的骨组织中含有各种活性细胞，包括成骨细胞、骨细胞以及破骨细胞等，发生坏死时成骨细胞(osteoblast，OB)的骨生成与破骨细胞(osteoclast，OC)的骨吸收的动态平衡状态被打破，OB的成骨活性减弱，而OC的骨吸收活性增强，从而形成恶性循环，导致坏死区进一步扩大。
　　骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是具有多向分化潜能的干细胞，能够在一定的微环境中向成骨细胞和破骨细胞分化，但向何种细胞分化取决于其所处的特定微环境，MSC在核因子KB受体活化因子配基(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL)等的诱导下会向OC分化，从而使骨吸收增强，股骨头坏死区存在RANKL等细胞因子，移植入坏死区的MSC一部分将会向破骨细胞分化。
　　体外冲击波(Extracorporeal Shock Wave，ESW)是由电子水压装置、电磁装置等产生的一种机械波，它可在固体和液体物质以及人体组织中发挥作用，能促进骨折断端、骨缺损区和骨坏死区骨细胞的增生，促进MSC向成骨细胞分化，具有确切的促进成骨细胞分化的作用。但ESW对股骨头坏死区MSC破骨分化的影响尚不明确，ESW对MSC移植治疗早期股骨头坏死是促进或是抑制临床中尚无相关研究。
　　本实验用ESW干预股骨头坏死区MSC向破骨分化的过程，探讨ESW对坏死区MSC向破骨分化的影响，并结合临床实验，为体外冲击波联合骨髓间充质干细胞移植治疗早期股骨头坏死提供更有力的证据。
　　第一部分体外冲击波对早期股骨头坏死区骨髓间充质干细胞破骨分化的影响
　　目的：
　　通过HE染色，鬼笔环肽染色和TRAP染色观察ESW干预股骨头坏死区MSC向破骨分化过程中细胞形态及数量的变化、RT-PCR观察破骨分化过程中特异基因表达的差异、扫描电子显微镜(scanning electronmicroscope，SEM)以及Coming Osteo骨细胞培养表面定量分析骨吸收能力，探讨ESW对股骨头坏死区MSC向OC分化的影响
　　方法：
　　1 MSC的获取及分组：在武警总医院行MSC移植治疗股骨头坏死的患者中，选取10名年龄18-30岁患者，在获得患者知情同意的情况下，行股骨头钻孔时，收集股骨头坏死区血约15mL，实验室分离提纯MSC，加入RANKL、M-CSF等细胞因子诱导为OC，ESW干预MSC向OC诱导为实验组，无ESW干预为对照组。
　　2 ESW干预对RANKL诱导MSC向QC分化过程的影响：在诱导OC的第1、3、5、7、9天分别给予2000频次0.25 mJ/mm2的ESW干预，在光镜下观察细胞形态及数目变化，HE染色，TRAP染色、鬼笔环肽荧光染色后，通过对多核细胞计数以及多核化率的计算，分析ESW对MSC向OC分化的影响；RT-PCR检测OC特异性基因表达水平的变化；SEM扫描骨吸收陷窝，并对陷窝面积及相对深度进行分析；Corning Osteo骨细胞培养表面定量分析其骨吸收能力。ESW干预为实验组，无ESW干预的为对照组，对实验结果进行t检验进行统计学分析，设定p<0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　1 MSC在50ng/ml RANKL以及25ng/ml M-CSF诱导下，从第7天开始，出现TRAP染色阳性(TRAP+)的多核破骨细胞，第14天出现大量OC，通过HE染色以及鬼笔环肽和Hoechst-33258荧光染色以及TRAP染色对3核以上的OC进行计数，并计算多核化率，进行统计学分析发现，实验组多核OC数以及多核化率与对照组相比差异均有统计学意义，ESW干预后，MSC向OC分化减少；RT-PCR技术检测OC特异性表达的基因TRAP和Cat K水平的变化，ESW组较对照组表达水平降低。
　　2将MSC接种在骨磨片上，加入诱导液第14天，用SEM扫描骨磨片吸收陷窝，Image J软件分析骨吸收陷窝的面积和相对深度，实验组分别为：12266.7±573.06μ m2，123.2±6.12，对照组为19557.9±711.39μm2，155.4±5.93，两组之间差异均有统计学意义(p<0.05)；MSC接种于Corning Osteo骨细胞培养表面，诱导培养第14天，光镜下观察吸收情况，并用Image J软件分析吸收面积，实验组为9124.5±915.85μ m2，对照组为15800.7±713.12μm2，二者差异有统计学意义(p<0.01)，ESW干预MSC诱导成的OC骨吸收能力降低。
　　结论：
　　1 ESW能够抑制MSC向OC的分化过程，使分化的多核OC的细胞形成数量明显减少，并使OC特异性基因表达水平降低；
　　2 ESW可有效抑制MSC分化成的OC的骨吸收能力，使骨吸收活性降低。
　　第二部分体外冲击波对骨髓间充质干细胞移植治疗早期股骨头坏死的影响的临床研究
　　目的：将ESW作用于MSC移植治疗早期ONFH患者，通过治疗前后Harris评分、MRI坏死面积的变化来评估治疗效果，探讨ESW对MSC移植治疗早期股骨头坏死的影响。
　　方法：
　　1实验对象的选取和干预措施：根据一定的纳入和排除标准，选取2010-03至2011-03在武警总医院收治的早期股骨头坏死患者(ARCO分期Ⅰ期和Ⅱ期)36例，男21例，女15例，年龄18～45岁，平均32岁，全部为单侧。其中24例按照随机数字表法事先随机分为2组，分别为MSC移植组和ESW+MSC组，每组12例，患者就诊时按着相应的随机分组序号进入各组。空白对照组12例，为门诊就诊的ONFH患者，拒绝临床治疗，但接受随访的患者。ESW组采用能流密度0.25-0.30 mJ/mm2，冲击频率60-100次/min，冲击次数2000次的ESW治疗，隔日一次，治疗5次为一疗程，患者共治疗2-3疗程，每一疗程之间间隔3个月；MSC移植组在手术室接受移植手术治疗；ESW+MSC组是MSC移植术后行ESW治疗，随访时间均为治疗后1年。
　　2 ONFH干预后治疗效果的评价：各组干预后1年对髋关节进行Harris评分，并与干预前的Harris评分进行统计学分析；利用Image J软件对干预前后同一层面髋关节MRI冠状位上股骨头坏死面积分析，并对数据进行配对t检验和方差分析。
　　结果：
　　1在随访1年后，MSC移植组、ESW+MSC组以及对照组髋关节Harris评分分别为：86±3.49，94.67±3.63，47.33±4.33，治疗前分别为：56.58±4.94，55.58±4，54，59.08±2.99，各组治疗前后差异均有统计学意义，治疗后MSC组和ESW+MSC组均较对照组差异有统计学意义，且ESW+MSC组较MSC组差异有统计学意义(p<0.05)。
　　2随访1年后，MRI冠状位同一层面上坏死面积由治疗前的1987.01±88.55μ m2，1976.13±98.99μ m2，1991.37±97.43μ m2，治疗1年后改变为：269.63±58.50μ m2，46.02±21.07μm2，2256.95±143.34μm2。通过统计学分析，各组治疗前后差异均有统计学意义，治疗后MSC组和ESW+MSC组均较对照组差异有统计学意义，且ESW+MSC组较MSC组差异有统计学意义(p<0.05)。
　　结论：
　　1 MSC移植以及ESW干预MSC移植治疗ONFH均有一定的治疗效果，且ESW干预MSC移植治疗早期ONFH能够获得更好的治疗效果。
　　2 ESW能够抑制MSC向破骨细胞分化可能是其能增强MSC移植治疗早期股骨头坏死的效果的另一个作用机制。