山莨菪碱对皮瓣缺血再灌注损伤保护机制的实验研究

摘要

目的：通过建立大鼠腹部皮瓣缺血再灌注损伤模型，观察山莨宕碱注射液对大鼠缺血再灌注皮瓣成活面积及组织学变化的影响，并通过测定皮瓣组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)、内皮素(ET)、肿瘤坏死因子(TNF-α)及核因子(NF)-κ B的含量，以期证实山莨宕碱具有防治皮瓣坏死、提高皮瓣成活率的疗效，并为临床防治各种组织瓣出现的缺血再灌注损伤，提高移植成活率提供新的思路和理论依据。
　　方法：
　　1实验动物：雄性健康清洁级Wistar大鼠48只，体重250～300g(购自河北医科大学实验动物中心)，予以编号。
　　2实验动物分组：把48只大鼠随机分为三组，每组16只。(1)缺血再灌注(ischemia reperfusion IR)组术前3天至术后3天，腹腔注射生理盐水2ml/kg，3/日，皮瓣形成后，用微血管夹夹闭腹壁浅动脉发出点近侧端的股动脉，皮瓣原位缝合，10h后去除动脉夹，恢复血供。(2)山莨宕碱缺血再灌注处理(Ani-ischemia reperfusion Ani-IR)组腹腔注射0.1％山莨宕碱注射液，剂量为8mg/kg，其余操作同IR组。(3)对照组，皮瓣形成后原位缝合，不做其他处理。
　　3皮瓣制备方法：动物术前三天应用8％硫化钠进行腹部脱毛，以2％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉。大鼠仰卧，四肢固定，75％酒精消毒，按照Petry JJ等描述的方法，于右下腹设计一大小为6cm×3cm轴形皮瓣，切开皮瓣四周皮肤，仅保留腹壁浅血管为皮瓣轴心，在皮下肉膜层剥离皮瓣，沿腹壁浅血管向近端分离，找到与股主动脉的交汇点，并向近端游离股动脉1cm，在此处用微血管夹夹闭股动脉(显微镜下确认股动脉被完全夹闭)，然后将皮瓣原位缝合。
　　4取材：IR组和Ani-IR组每组取8只大鼠，在皮瓣切开后即刻、去除血管夹再灌注2小时、8小时及24小时各时间点于皮瓣中段取材，对照组取8只大鼠与IR组和Ani-IR组同时取材，把所取的皮瓣组织分为两部分，一部分放入超低温冰箱冰冻保存，待取材完毕后用于生化检测；另一部分给予4％多聚甲醛固定，待取材完毕后用于做石蜡切片及检测皮瓣中免疫组化指标；每组剩余的8只大鼠用于肉眼观测术后皮瓣变化情况及7天后分析测量皮瓣成活率。
　　5检测方法及指标：
　　5.1皮瓣肉眼观察：术后第7天皮瓣成活情况已基本确定，用肉眼观察皮瓣颜色、温度、质地及出血情况，并进行大致判断。
　　5.2皮瓣成活率测定：术后第7天用数码相机对皮瓣进行摄像，并把信息并输入电脑，使用Image-Pro Plus.v6.0软件，分析并测定皮瓣成活率(皮瓣成活率＝皮瓣存活面积/皮瓣总面积×100％)。
　　5.3皮瓣组织学检查：将制备好的石蜡切片进行HE染色，电子显微镜下观察组织结构变化情况。
　　5.4皮瓣组织生化检测：按照不同试剂盒说明书，分别检测不同时刻所取皮瓣组织中SOD、MDA、NO、ET含量，考马斯亮蓝液中加入皮瓣组织测定吸光度，用于蛋白定量。所有生化检测SOD、MDA、NO、ET值均经考马斯亮蓝蛋白校正。
　　5.5 TNF-α及NF-κ B测定：所取组织进行免疫组化染色，光镜观察TNF－α及NF-κ B表达量和分布情况。应用HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统软件，每张切片随机取5个互不重叠的400倍视野，测其阳性细胞光度值后求其平均数。
　　6统计学处理：所有数据以x-±S表示，用SPSS13.0软件统计处理，皮瓣成活率、MDA、SOD、NO、ET、TNF-α、NF-κB数据采用单因素方差分析法，组间采用q检验，P<0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　1皮瓣肉眼观察：
　　术后第7天，IR组皮瓣除近端少许组织成活，其余绝大部分呈黑褐色，质地干燥呈痂皮状，无弹性，无毛发生长，触之温度明显较正常皮肤低，5号注射器针头刺入无出血。掀起皮瓣，可见皮瓣下有较多炎性分泌物。Ani-IR组皮瓣成活面积明显大于IR组，可见大部分皮瓣生长良好，水肿较轻，颜色及质地正常，可见毛发生长，皮温较正常，5号注射器针头刺入可见鲜红色血液流出；仅远端呈暗褐色，质地较韧，无弹性，无出血，呈坏死状；掀起皮瓣可见成活皮瓣边缘及基底有活动性出血，仅坏死区域存在少量炎性分泌物。对照组皮瓣颜色淡红，温度及质地正常，可见毛发生长，未见坏死。
　　2皮瓣成活率：IR组(35.1±6.1)％，Ani－IR组(78.6±7.3)％，对照组100％，Ani－IR组与IR组成活率比较有显著性差异(P<0.05)。
　　3组织学检查：对照组各时段皮下组织水肿较轻，炎症反应轻，未见坏死征象。Ani-IR组术后2h，表皮开始出现角质层剥脱，局部轻微破损；8h皮下组织水肿明显，皮肤各层结构疏松、紊乱，少量嗜中性粒细胞粘附、聚集于血管壁，部分微血管管壁损伤，完整性破坏，通透性增加，可见嗜中性粒细胞浸润到组织间隙；24h情况较前略有好转，但仍有大量嗜中性粒细胞浸润。IR组：各时段组织损伤均较Ani-IR组重，24h表皮层已经部分坏死，结构破坏，大量微血管管壁损伤，通透性增加，组织间隙有更多的嗜中性粒细胞浸润。
　　4组织生化检查：
　　4.1 SOD测定：制成皮瓣即刻测量三组皮瓣组织中SOD含量，结果统计学比较无显著性差异(P>0.05)；再灌注后2小时、8小时、24小时，对照组术后12小时、18小时、34小时各时间点测得SOD值均呈现：Ani-IR组>IR组>对照组(P均<0.05)，且差异有统计学意义。
　　4.2 MDA测定：制成皮瓣即刻测量三组皮瓣组织中MDA含量，结果统计学比较无显著性差异(P>0.05)；再灌注后2小时、8小时、24小时，对照组术后12小时、18小时、34小时各时间点测得MDA值均呈现：IR组>Ani－IR组>对照组(P均<0.05)，且差异有统计学意义。
　　4.3 NO测定：制成皮瓣即刻测量三组皮瓣组织中NO含量，结果统计学比较无显著性差异(P>0.05)；再灌注后2小时、8小时、24小时，对照组术后12小时、18小时、34小时各时间点测得NO值均呈现：对照组>Ani－IR组>IR组(P均<0.05)，且差异有统计学意义。
　　4.4 ET测定：制成皮瓣即刻测量三组皮瓣组织中ET含量，结果统计学比较无显著性差异(P>0.05)；再灌注后2小时、8小时、24小时，对照组术后12小时、18小时、34小时各时间点测得ET值均呈现：IR组>Ani-IR组>对照组(P均<0.05)，且差异有统计学意义。
　　5免疫组化染色结果：
　　5.1 NF-κB测定：制成皮瓣即刻不同实验组皮瓣检测NF-κB均未见阳性表达，再灌注2小时IR组、Ani-IR组中性粒细胞和血管内皮细胞出现NF-κB较强阳性表达。IR组和Ani-IR组再灌注后2小时、8小时，对照组术后12小时、18小时各时间点测得NF-κB平均光度值均呈现：IR组>Ani-IR组>对照组(P均<0.05)，差异有统计学意义。
　　5.2肿瘤坏死因子(TNF-α)测定：掀起皮瓣后即刻三组均见TNF-α在血管内皮细胞上有极少量的表达，但其表达量较小，无法定量。再灌注2小时IR组、Ani-IR组上皮细胞和血管内皮细胞出现TNF-α较强阳性表达。再灌注后2小时、8小时，对照组术后12小时、18小时各时间点测得TNF-α平均光度值均呈现：IR组>Ani-IR组>对照组(P均<0.05)，差异有统计学意义。
　　结论：
　　山莨宕碱能够减轻再灌注后皮瓣组织内自由基损伤，增加皮瓣术后血运，减少核因子(NF)-κB和TNF-α的产生，减轻炎症反应，增强皮瓣抗感染能力，从而可有效减轻皮瓣缺血再灌注损伤，降低皮瓣坏死率，提高皮瓣移植成活率。