百草枯中毒大鼠组织中ICAM-1与TNF-A的表达及5-氨基水杨酸的治疗干预研究

摘要

目的：百草枯(paraquat，PQ)，是世界范围内广泛使用的一种快速灭生性除草剂。其在我国农业领域里亦广泛应，故一直以来PQ中毒病例在我国屡见不鲜。PQ对人体毒性较强，仅微量中毒便可致死，且目前尚无任何特效解毒药，临床病死率极高，如今已被20多个国家明令禁止或严格限制使用。目前PQ中毒引起肾脏损伤的机制尚未完全明确。本实验通过建立PQ染毒大鼠模型，测定其血清超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)活力以及谷胱甘肽(L-Glutathione，GSH)、丙二醛(MaleicDialdehyde，MDA)含量，应用免疫组织化学染色方法观察细胞间粘附因子-1(ICAM-1)及肿瘤坏死因子-a(TNF-a)在PQ染毒大鼠肾组织中的表达，并在此基础上，通过应用5-氨基水杨酸(5-Aminosalicy acid，5-ASA)观察上述指标的变化规律，从而进一步探讨PQ中毒对肾脏损伤的机制以及5-ASA对百草枯染毒大鼠肾损伤的保护机制。
　　方法：选择健康的成年雄性Wistar大鼠80只，体重在200-230g之间。饲养室室温控制在22-26℃之间，进行短期实验性饲养，后将大鼠随机分为4组：①对照组(A组)20只；②染毒组(B组)20只；③；染毒+治疗组(C组)20只；④单纯治疗组(D组)20只。实验当天早晨8点，B、C两组分别给予80mg/kg的PQ灌胃染毒，A、D两组分别给予相同体积的双蒸水胃内灌注。2小时后，C、D两组分别给予75mg/kg的5-ASA胃内灌注，A、B两组分别给予相同体积的双蒸水胃内灌注。自第2天上午，C、D两组分别给予75mg/kg的5-ASA胃内灌注，A、B两组分别给予相同体积的双蒸水胃内灌注，每日1次，最长用药时间为7天。A、B、C、D各组于实验后1d、3d、7d、14d分别取5只大鼠，给予10％水合氯醛0.35mg/kg腹腔内注射麻醉后开腹，从髂总静脉取血3-4ml，高速离心10min(4000r/h)，取上层血清测定SOD活力以及GSH、MDA含量；迅速留取一侧肾脏进行HE染色，镜下观察超微组织结构，并行免疫组织化学染色，观察ICAM-1及TNF-a在大鼠肾组织中的表达情况。
　　结果：
　　1大鼠临床表现：A组及D组大鼠未观察到明显中毒表现。B组大鼠在染毒后2小时之内即出现体毛直立，精神差，烦躁，厌食水等中毒表现；之后多数大鼠尿量减少，体重减轻，部分大鼠出现呼吸困难、稀便、口鼻可见血性分泌物。C组大鼠经5-ASA治疗后，中毒表现较B组为减轻，仅偶见呼吸困难症状，体重下降不明显，稀便及口鼻、眼周血性分泌物少见。
　　2大鼠血清学指标检测：
　　①B组大鼠血清SOD活力在染毒后1d最低，至7d时间点仍明显低于A组(P＜0.01)，后逐渐升高，至14d后与A组相比不再具有统计学意义(P＞0.05)。C组大鼠血清SOD活力在染毒后的1d、3d、7d时间点均较B组明显升高，具有统计学意义(P＜0.05)；仅1d、3d时间点较A组具有统计学意义(P＜0.01)。D组与A组比较，SOD活力在染毒后的1d、3d、7d时间点均不具有统计学意义(P＜0.01)。
　　②B组大鼠血清GSH含量在染毒后的1d为最低，至3d时间点仍明显低于A组(P＜0.01)，后逐渐升高，至7d后与A组相比不再具有统计学意义(P＞0.05)。C组大鼠血清GSH含量在染毒后的1d、3d、7d时间点均较B组明显升高，具有统计学意义(P＜0.05)；所有时间点较A组均不具有统计学意义(P＞0.05)。D组与A组比较，GSH含量在染毒后的1d、3d、7d时间点均不具有统计学意义(P＜0.01)。
　　③B组大鼠血清MDA含量在染毒后的1d为最高，至7d时间点仍明显高于A组(P＜0.01)，后逐渐下降，至14d后与A组相比不具有统计学意义(P＞0.05)。C组大鼠血清MDA含量在染毒后的1d、3d、7d时间点均较B组明显降低(P＜0.05)，仅1d、3d时间点较A组具有统计学意义(P＜0.05)。D组与A组比较，MDA含量在染毒后的1d、3d、7d时间点均不具有统计学意义(P＜0.01)。
　　3实验大鼠肾组织形态学变化：
　　①肉眼观察：A组大鼠肾脏色泽红润，被膜无肿胀；B组大鼠肾脏色泽深暗，被膜肿胀；C组大鼠肾脏与B组相比颜色较红，被膜肿胀较轻；D组大鼠肾脏色泽红润，被膜无肿胀。
　　②镜下观察：A组大鼠肾脏肾小球、肾小管、肾间质均未见异常；B组大鼠肾组织改变以肾小管为主，逐渐可见上皮细胞水肿、空泡变性、渗出坏死、管腔内可见坏死颗粒；C组大鼠肾组织改变较B组程度有所减轻，且较晚出现；D组大鼠肾组织未见异常。
　　4实验大鼠肾组织ICAM-1与INF-a免疫组织化学检测结果：
　　4.1 ICAM-1在大鼠肾组织中的表达与分布
　　①ICAM-1的表达：A组大鼠肾组织中，仅在肾小管细胞膜处可见少量ICAM-1表达，在肾小球，肾小管周围毛细血管及血管内皮细胞处均未见ICAM-1明显表达
　　②B组大鼠肾组织中，可见ICAM-1在肾小管及肾小球细胞膜处广泛表达，与A组相比有统计学意义(P＜0.01)，于7d达高峰，此后表达有所下降，但14d表达仍高于A组，与A组相比具有统计学意义(P＜0.05)。
　　③C组大鼠肾组织中，可见ICAM-1在肾小管及肾小球细胞膜处表达，且表达自1d至14d时间点均较B组明显降低，与B组相比具有统计学意义(P＜0.05)；但表达在1d至14d时间点仍高于A组(P＜0.01)
　　④D组大鼠肾组织中的ICAM-1表达与A组无明显差异
　　4.2 TNF-a在大鼠肾组织中的表达与分布：
　　①A组大鼠肾组织中，仅在肾小管内皮细胞的胞浆内偶可见TNF-a表达，而在肾小球周围毛细血管等肾间质区未见TNF-a明显表达。
　　②B组大鼠肾组织中，TNF-a主要表达在肾小管内皮细胞的胞浆内，自1d时间点开始就显著增高，至7d到达高峰，且至14d仍有明显表达，与A组比较具有统计学意义(P＜0.01)。
　　③C组大鼠肾组织中，TNF-a亦主要表达在肾小管内皮细胞的胞浆内，自1d至14d其表达较B组明显减弱，具有统计学意义(P＜0.05)；与A组相比，自1d至14dTNF-a的表达较高，具有统计学意义(P＜0.01)。
　　④D组大鼠肾组织中，TNF-a同样主要表达在肾小管内皮细胞的胞浆内，与A组无明显差异。
　　结论：
　　1 PO灌胃染毒可引起肾脏损伤，且在短期内就可发现，表明PQ灌胃染毒是建立急性肾损伤动物模型的可靠方法。
　　2 PQ染毒大鼠血浆SOD活力及GSH含量减少，MDA含量增加，表明氧自由基的产生及脂质过氧化反应的发生可能是PQ导致肾脏损伤的机制之一；PQ染毒大鼠肾组织中ICAM-1及TNF-a的表达可发生改变，表明此两种细胞因子可能在PQ所致肾损伤过程中发挥作用。
　　3染毒大鼠在应用5-ASA治疗之后，可明显增加PQ中毒大鼠血清SOD活力及GSH含量，降低MDA含量，说明5-ASA可降低肾组织的过氧化损伤。
　　45-ASA可能通过抑制氧自由基的生成或直接清除氧自由基及其抗炎机，间接抑制体内ICAM-1及TNF-a的表达，从而减轻PQ所致肾损伤。