线粒体基因组D-Loop区基因多态性与肺癌相关性研究

摘要

目的：肺癌已经成为对人类健康和生命危害性最大的恶性肿瘤之一，近年来，随着环境的污染和生活节奏的加快，肺癌的发病率和死亡率有明显增高趋势，其发病率和死亡率的增长速度也均居于肿瘤的首位，在全世界[1]中，每年大约有110多万人死于肺癌，约占癌症死亡总数的17.8％，虽然肺癌中Ⅰ期5年生存率可以达到70％左右，但其总的肺癌5年生存率却不足15％，其原因主要是80％肺癌患者确诊时已属于晚期，失去了手术治疗的时机。目前人们对肺癌的发生机制了解还不十分清楚，在临床上，对于肺癌的早期诊断和治疗也没有理想的方法[2、3]。比较明确的肺癌危险因素是吸烟，但是有些长期吸烟人群没有患肺癌，而有些不吸烟的人群却患了肺癌，说明肺癌的发生除了与一些环境因素有关外，还和人体内基因不同有关。
　　人类体细胞中，除了成熟的红细胞外，均含有线粒体，线粒体是真核生物中重要的细胞器，是细胞能量代谢的中心，线粒体还在真核细胞的物质代谢、细胞凋亡、衰老等生理、病理过程中起着重要的作用[4、5]。线粒体DNA(mtDNA)是目前为止发现的唯一的核外遗传物质。它能够不依赖核基因自行完成复制、转录、翻译等过程。mtDNA基因全序列是由Aderson等人于1981年第一次测定完成，此序列又被称为Combridge序列，在人类mtDNA相关研究中常常作为参考序列[6]。
　　MtDNA为一条双链闭合环状结构。它由16569个碱基组成，共编码37个基因。由于其缺乏组蛋白的保护及损伤修复能力差，同时又直接处于高氧环境下，容易产生氧自由基等，以及不能将其有效地清除，因此线粒体DNA变异在退行性、代谢性以及肿瘤等疾病中广泛存在。线粒体DNA可分为编码区及非编码区，D-环区是mtDNA的非编码区，位于tRNAPhe和tRNApro之间，全长约1122bp(16024-576)，由于此区含A、T碱基较多，是mtDNA与线粒体内膜的相结合位点，容易受脂质过氧化物等的损伤，以及它是mtDNA复制、转录的主要调控区域，因此D-环区是mtDNA突变及多态性的高变区。近年来，在肝细胞癌、胃肠道肿瘤，头颈部肿瘤、乳腺癌等多种肿瘤中发现了D-loop多态性情况，并且不同肿瘤的多态性位点不同，但对D-loop区多态性与肺癌的关系，目前研究甚少，本研究拟通过对肺癌患者及正常体检者的外周血组织mtDNA的D-loop区测序对比分析，采用病例-对照研究，对比D-loop区多态性位点基因的出现频率以及多态性分布趋势上的区别，探讨D-loop区基因多态性与肺癌遗传易感性是否相关，并分析基因-环境(吸烟)的相互之间的作用，旨在为确定肺癌遗传易感性标记提供依据。
　　方法：收集自2001年至2011年就诊于河北医科大学第四医院、经组织病理或细胞病理确诊的121例肺癌患者及91例正常体检者的资料，采用聚合酶链反应(Polymerase chain re-action，PCR)及直接测序来检测肺癌患者与正常对照者白细胞中线粒体基因的D-loop环区基因多态性位点情况；数据统计通过SPSS13.0版进行分析。
　　结果：
　　1病例组与对照组临床资料对比：年龄、性别在两组之间无显著性差异(P值分别为0.969、0.114)，两组匹配；病例组中吸烟者占46.3％，显著高于对照组的26.4％(P＝0.003)。
　　2在全长982bp的测序序列中，与剑桥序列相比，病例组121例患者中，发现174个多态性位点，多态率17.72％；91例对照组中，发现106个多态性位点，多态率10.79％。两组之间有显著性差异(x2＝19.260，P＝0.000)。
　　3分别对肺癌组中按性别、年龄、病理分组统计位点变异个数，73名男性患者共有737个变异，48名患者中共有472个变异；＞50岁的96名患者中有959个变异，≤50岁的25名患者中有250个变异；28名鳞癌患者中291个变异，65名腺癌患者中629个变异，28名小细胞肺癌患者中289个变异。结果提示病例组中位点变异数在性别、年龄、病理分组(P分别为0.337、0.508、0.406)中均无统计学意义。
　　4本组研究中，病例组中D-loop区16247位点的碱基A缺失频率显著高于对照组(5.8％vs.0％，P＝0.018)；病例组中D-loop区489位点T/C变异显著高于对照组(58.7％ vs.46.2％，P＝0.047，OR＝1.657，95％CI=0.957～2.867)。
　　5吸烟与两种肺癌易感基因多态联合效应分析
　　将吸烟与否进行分层后，再分析上述两个位点单核苷酸多态性与肺癌发生的关系。所有吸烟者中，病例组中D-loop区16247位点的有7.1％发生碱基A缺失，对照组中无碱基A缺失现象；在489位点上有病例组中有50％发生了T→C转换，在对照组中有41.7％发生了T→C转换，在上述两个位点上经统计学分析，均无统计学差异(P＞0.05)。
　　所有不吸烟者中，在16247位点上病例组中有4.6％发生碱基A缺失，对照组中无碱基A缺失现象，两组无统计学差异(P＞0.05)；而在489位点上有病例组中有66.2％发生了T→C转换，在对照组中有47.8％发生了T→C转换，两组之间相比有统计学意义(P＝0.037，OR＝2.138，95％CI＝1.059～4.316)，即在除外吸烟与否对肺癌发病风险的影响下，携带C碱基的个体患肺癌的风险为携带T碱基者的2.138倍。
　　在489位点上，既吸烟又携带C碱基者患肺癌的风险为不吸烟携带T碱基者的4.455倍，吸烟者但携带T碱基者为携带相同碱基但不吸烟者的3.182倍，携带C碱基的不吸烟者患肺癌的风险为携带T碱基不吸烟者的2.138倍。
　　结论：
　　1在本研究人群中，吸烟仍是肺癌发生的环境危险因素。
　　2 D-环区16247位点碱基A的缺失与肺癌的发生有关，489位点T→C变异与肺癌发生有关，携带C碱基的者患肺癌的风险为携带T碱基者的1.657倍。
　　3 D-loop区变异个数与肺癌患者的年龄、性别以及肿瘤的病理类型无关。
　　4在489位点上T/C多态性与吸烟间呈现交互作用，在除外吸烟与否对肺癌发病风险的影响下，携带C碱基的者患肺癌的风险为携带T碱基者的2.138倍，含有C碱基-吸烟患肺癌的风险最高。