硼替佐米及其联合5-杂氮胞苷对T细胞淋巴瘤细胞中NF-KB,SHP-1,JAKs基因表达的影响

摘要

目的：淋巴瘤是来源于淋巴细胞的实体恶性肿瘤，按照“世界卫生组织淋巴系统肿瘤病理分类标准”，目前已知淋巴瘤有近70种病理类型，大体可分为霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)两大类。在我国，霍奇金淋巴瘤占淋巴瘤的10％左右，而非霍奇金淋巴瘤占全部淋巴瘤病例的90％左右，并且发病率逐年升高。非霍奇金淋巴瘤又分为B细胞型和T/NK细胞型两大类，其中T细胞淋巴瘤约占所有非霍奇金淋巴瘤的25％左右。
　　硼替佐米(Bortezomib，万珂)是一种高选择性的26S硼酸盐蛋白酶体抑制剂，目前已经被应用于临床治疗多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤。在肿瘤细胞中，硼替佐米主要通过对核转录因子(NF-κB)等多种细胞内蛋白质发挥作用，已有研究证明，硼替佐米特异性地抑制蛋白酶体26S亚基的活性，明显减少抑制因子(iκB)的降解，iκB和NF-κB结合的增加，可以有效抑制NF-κB的活性，减少NF-κB进入细胞核诱导或上调多药耐药基因，抑制与细胞增殖相关的基因表达，从而抑制细胞过度增殖和诱导细胞正常凋亡。
　　本课题前期研究已经证明，淋巴瘤患者及其细胞系中存在酪氨酸磷酸酶-1(SH2-containing tyrosine phosphatase-1，SHP-1)基因的表达减低或缺如，甲基化抑制剂5-杂氮胞苷(5-aza-CdR)可以通过诱导淋巴瘤细胞中SHP-1重新表达而抑制肿瘤细胞增殖，蛋白酶体抑制剂硼替佐米(BTZ)增强5-杂氮胞苷对Jurkat细胞的去甲基化作用。已经证实，SHP-1能抑制JAKs激酶活性而负调控JAK/STAT信号通路，还可以通过蛋白酶体途径加速JAKs激酶的降解而发挥其促凋亡作用。
　　本实验研究硼替佐米作用于T细胞淋巴瘤Jurkat细胞后NF-κB基因的表达情况。硼替佐米单药及其与5-杂氮胞苷联合作用于Jurkat细胞后，SHP-1及JAK家族成员JAK1，JAK2，JAK3，TYK2基因的表达情况，了解SHP-1在JAK/STAT通路中的作用，以及在T细胞淋巴瘤发病中的作用。
　　方法：本实验的研究对象为T细胞淋巴瘤Jurkat细胞株。将细胞悬浮培养于10％胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)RPMI1640培养基中，取对数生长期的细胞转入6孔培养板，每孔1ml含1×106个细胞，硼替佐米的浓度为10，30，50nmol/L(共3孔)；硼替佐米10nmol/L+5-aza-CdR3μmol/L(1孔)；不加药对照一孔(共5孔)，5种不同处理组细胞均各设2个复孔。细胞和药物在37℃，5％CO2饱和湿度条件下孵育24 h，48 h，72 h后收获并洗涤，Trizol提取细胞总RNA，荧光实时定量PCR(real-timequantitative poylymerase chain reaction，RQ-PCR)检测NF-κB，SHP-1及JAK家族成员JAK1，JAK2，JAK3，TYK2基因的表达情况，并进行统计学分析。
　　结果：
　　1.NF-κB基因在硼替佐米作用的Jurkat细胞中的表达：RQ-PCR结果显示，相同浓度的硼替佐米作用于Jurkat细胞，呈时间依赖性，随着时间增加NF-κB基因的表达逐渐降低；在相同时间不同浓度的硼替佐米作用于Jurkat细胞，NF-κB基因表达呈剂量依赖性，随着剂量的增加其表达逐渐降低。P<0.05，有统计学意义。
　　2.硼替佐米和5-杂氮胞苷在Jurkat细胞中对SHP-1表达的影响：RQ-PCR结果显示，相同浓度的硼替佐米作用于Jurkat细胞24 h～72 h同对照组相比，SHP-1 mRNA平均表达水平逐渐升高，有显著差异，有统计学意义(P<0.05)。在相同时间不同浓度的硼替佐米作用于Jurkat细胞后，SHP-1 mRNA平均表达水平随剂量的增加而逐渐升高，有显著差异，有统计学意义(P<0.05)。硼替佐米与5-杂氮胞苷两药联合作用于Jurkat细胞24～72h后，Jurkat细胞中SHP-1 mRNA表达水平增加，较单药时更明显。与硼替佐米单药作用时相比有统计学差异。
　　3.硼替佐米和5-杂氮胞苷在Jurkat细胞中对JAKs表达的影响：RQ-PCR结果显示，相同浓度的硼替佐米作用于Jurkat细胞24 h～72 h同对照组相比，JAKs mRNA平均表达水平逐渐降低，有显著差异，有统计学意义(P<0.05)。在相同时间不同浓度的硼替佐米作用于Jurkat细胞后，JAKs mRNA平均表达水平随剂量的增加而逐渐降低，有显著差异，有统计学意义(P<0.05)。硼替佐米与5-杂氮胞苷两药联合作用于Jurkat细胞24～72h后，Jurkat细胞中JAKs mRNA表达水平降低，较单药时更明显。与硼替佐米单药作用时相比有统计学差异。
　　4.Shp-1与JAKs家族(JAK1，JAK2，JAK3，TYK2)之间的相关性SHP-1与JAK1，JAK2，JAK3，TYK2的表达水平呈负相关，JAK1下降程度更为明显。
　　结论：
　　1.硼替佐米可能通过抑制NF-κB途径，减少进入细胞核的具有活性的NF-κB的量，抑制与Jurkat细胞增殖相关的基因的表达，诱导细胞凋亡。
　　2.硼替佐米和5-杂氮胞苷可以增加Jurkat细胞中SHP-1mRNA的表达，降低JAKs家族(JAK1，JAK2，JAK3，TYK2)的表达，呈剂量和时间依赖性，并且两种药物有协同的作用。抑癌基因SHP-1表达升高，可能通过抑制JAK/STAT信号通路发挥作用，调节与细胞增殖分化相关的基因，从而抑制肿瘤细胞的生长，诱导其凋亡。其中JAK1的影响更为显著。