SD大鼠主动脉瓣间质细胞自发钙化模型的建立及阿托伐他汀和氨氯地平的影响

摘要

钙化性主动脉瓣疾病是一个慢性进展性疾病，包括早期的主动脉瓣硬化(aortic sclerosis，ASc)和晚期的钙化性主动脉瓣狭窄(calcific aortic valvestenosis，CAS)。在欧、美等发达国家，CAS已成为成人最常见的心脏瓣膜病；且患者一旦出现临床症状，预后较差。随着研究的深入，对CAS的认识逐渐从“与年龄相关的退行性过程”过渡到认为其是“主动调节的慢性炎症过程”。临床来源的的主动脉瓣标本数量有限，且钙化较严重；用猪、兔等建立的动物模型，耗时较长且较繁琐，故建立有效的体外疾病模型显得尤为重要。
　　主动脉瓣间质细胞(aortic valve interstitial cells，AVICs)在CAS发生发展中起重要作用。目前用于CAS研究的AVICs多来源于猪，但由于缺乏相应一抗，使研究受限。在有关CAS的体外研究中，多通过不同种类或浓度的钙化诱导剂或刺激因子诱导AVICs钙化，这使得试验间结论的可比性较差。SD大鼠是一种常用的实验动物，具有体积小、易饲养、易购买等优点。目前以SD大鼠为研究对象对CAS进行的研究较少，可能与大鼠主动脉瓣较小，不易分离培养有关。
　　本研究欲分离培养SD大鼠AVICs，并观察其在未给予钙化诱导剂或刺激因子的情况下，随着培养时间的延长是否自发形成钙化灶；并检测钙化过程中钙化相关因子的表达情况，同时观察阿托伐他汀及氨氯地平对自发钙化的影响。
　　第一部分 SD大鼠主动脉瓣间质细胞分离培养
　　目的：建立快速有效的SD大鼠AVICs体外培养方法。
　　方法：通过组织块法分离培养SD大鼠AVICs，观察细胞原代及传代后生长特性；并通过IF染色方法检测a-SMA及vimentin表达情况；通过SEM和TEM对细胞表面和内部结构进行观察。
　　结果：
　　1、原代培养2～3天后，部分组织块周边有细胞爬出，呈梭形、三角形或不规则形；原代培养7～8天后，细胞可达到70～80％融合，进行传代。
　　2、AVICs经IF检测阳性，即SD大鼠AVICs表达a-SMA及vimentin。
　　3、经SEM检测可见，细胞贴壁良好，多边形，体积较大，细胞膜较薄且充分伸展。
　　4、经TEM检测可见，细胞体积较大，不规则形，可见绒毛；胞内细胞器丰富，可见大量扩张的粗面内质网及与细胞长轴平行的肌丝；细胞核不规则，可见核仁。
　　结论：
　　1、通过组织块法对SD大鼠AVICs进行培养，方法简单快速。
　　2、经过形态学、细胞免疫学鉴定，SD大鼠AVICs为肌成纤维细胞。
　　第二部分 SD大鼠主动脉瓣间质细胞自发钙化模型的建立
　　目的：观察体外分离培养的SD大鼠AVICs是否可以自发形成钙化灶。
　　方法：通过组织块法分离培养SD大鼠AVICs，对不同培养时间的AVICs进行Von Kossa及茜素红染色、细胞内及其间质钙离子检测，评价其是否可以自发形成钙化灶。
　　结果：
　　1、培养至4～6天时，AVICs逐渐聚集成团，称为“细胞灶”，此时细胞灶较小，散在分布；随着培养时间的延长，细胞灶体积逐渐增加，中心区亮度增加。
　　2、Von Kossa染色显示，6天时细胞灶染色阳性，即细胞灶处有钙盐沉积；并且12天时阳性细胞灶个数及强度均大于6天组。
　　3、茜素红染色显示，6天时细胞灶染色阳性，即细胞灶处有钙盐沉积；并且12天时阳性细胞灶个数及强度均大于6天组。经统计分析显示，茜素红含量组间有统计学差异(F=106.167，P<0.001)，0天及6天组茜素红含量较低，12天组茜素红含量较高，即随着培养时间的增加钙盐沉积增加。
　　4细胞及间质钙含量经统计分析显示，钙离子含量组间有统计学差异(F=116.379，P<0.001)，0天及6天组钙离子含量较低，12天组钙离子含量较高，即随着培养时间的增加钙盐沉积增加。
　　结论：通过延长细胞培养时间能够诱导其自发形成钙化灶。
　　第三部分 SD大鼠主动脉瓣间质细胞自发钙化模型的机制研究
　　目的：检测AVICs在自发钙化过程中某些成骨相关基因的表达情况。
　　方法：通过组织块法分离培养SD大鼠AVICs，用RT-PCR和western-blot方法，检测不同培养时间细胞的ALP活性、成骨相关因子(α-SMA、Cbfa1、Osteocalcin、ALP、BMP-2、BMP-4)mRNA及蛋白表达情况。
　　结果：
　　1、ALP活性检测结果表明，0天、6天、12天组ALP活性有统计学差异(x2=139.396，P<0.001)，12天组ALP活性最低，0天组ALP活性较高，6天组ALP活性最高，即随着培养时间的增加，ALP活性从0天开始逐渐升高，至第6天达峰，之后逐渐下降。
　　2、Cbfa1 mRNA、Osteocalcin mRNA、BMP-4 mRNA、ALP mRNA、BMP-2mRNA、α-SMA mRNA RT-PCR检测结果
　　2.1 Cbfa1 mRNA、Osteocalcin mRNA、BMP-4 mRNA RT-PCR结果表明，0天、6天、12天组Cbfa1 mRNA、Osteocalcin mRNA、BMP-4 mRNA表达水平有统计学差异(F=410.106，x2=7.200，F=38.463，P<0.005)，0天组最低，6天组较高，12天组最高，即随着培养时间的增加Cbfa1 mRNA、Osteocalcin mRNA、BMP-4 mRNA表达水平逐渐增高。
　　2.2 ALP mRNA RT-PCR结果表明，0天、6天、12天组ALP mRNA表达水平有统计学差异(x2=7.200，P=0.027)，0天最低，12天较高，6天最高，即随着培养时间的增加，ALP mRNA的表达水平先增加后下降。
　　2.3 BMP-2 mRNA RT-PCR结果表明，0天、6天、12天组BMP-2 mRNA表达水平有统计学差异(F=56.565，P<0.001)，0天组较低，6天组和12天组较高，即随着培养时间的增加，BMP-2 mRNA的表达水平逐渐增加。
　　2.4α-SMA mRNA RT-PCR结果表明，0天、6天、12天组α-SMA mRNA表达水平有统计学差异(F=89.886，P<0.001)，12天最低，6天较高，0天最高。随着培养时间的增加α-SMA mRNA的表达水平逐渐下降。
　　3、ALP、BMP-2、BMP-4 western-blot结果
　　3.1 ALP western-blot结果表明，0天、6天、12天组ALP蛋白表达水平有统计学差异(x2=7.261，P=0.027)，0天组最低，12天组较高，6天组最高，即随着培养时间的增加，ALP蛋白表达先增高后降低。
　　3.2 BMP-2、BMP-4 western-blot结果表明，0天、6天、12天组BMP-2、BMP-4蛋白表达水平有统计学差异(x2=7.200，F=452.482，P<0.05)，0天组最低，6天组较高，12天组最高，即随着培养时间的增加BMP-2、BMP-4蛋白表达逐渐增高。
　　结论：AVICs向成骨细胞表型转化可能是自发钙化模型形成的细胞学基础。
　　第四部分阿托伐他汀和氨氯地平对SD大鼠主动脉瓣间质细胞自发钙化的影响
　　目的：观察阿托伐他汀和氨氯地平对SD大鼠AVICs自发钙化的影响。
　　方法：采用组织块法分离培养SD大鼠AVICs，检测不同浓度的阿托伐他汀和氨氯地平对AVICs自发钙化程度及ALP活性的变化情况。
　　结果：
　　1、通过延长培养时间，各组均形成直径大小不同的钙化灶。
　　2、Ato和Aml对AVICs自发钙化程度的影响
　　2.1在控制了组别因素的情况下，时间因素在不同水平有统计学差异：0天和6天较低，12天较高(F=116.379，P<0.001)，即随着培养时间的增加各组Ca2+含量均逐渐增高。
　　2.2在控制了时间因素的情况下，组别问有统计学差异，10-6mol/L Aml组比10-6mol/L Ato组钙含量高，两组间有统计学差异(F=3.655，P=0.023)，其他组间均无统计学差异，即在相同的培养时间情况下，除10-6mol/L Aml组和10-6mol/L Ato组Ca2+含量有差别外(10-6mol/L Aml组Ca2+含量高于10-6mol/L Ato组)，其余各组均无差别。
　　3、Ato和Aml对ALP的影响
　　3.1在控制了组别因素的情况下，时间因素在不同水平有统计学差异：12天最低，0天较高，6天最高(F=139.396，P<0.001)，即随着培养时间的增加各组ALP活性先增加后降低。
　　3.2在控制了时间因素的情况下，组别间无统计学差异(F=0.515，P=0.675)，即在培养时间相同的情况下，不同浓度的药物对ALP活性变化无影响。
　　结论：
　　1、1×10-7～1×10-6mol/L浓度的Ato对SD大鼠AVICs钙化无明显影响。
　　2、1×10-7～1×10-6mol/L浓度的Aml对SD大鼠AVICs钙化无明显影响。