白藜芦醇对高糖诱导的大鼠胸主动脉平滑肌细胞MMP-2、MMP-9表达的影响及其作用机制的研究

摘要

目的:糖尿病心脑血管病变是糖尿病的常见慢性并发症之一，也是糖尿病患者致死的最主要原因。心脑血管病变的发生与长期高血糖状态导致的动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)关系密切，血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)向内膜迁移并在内膜增殖则在AS发生发展过程中起着关键作用。
　　 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是一组依赖于金属离子的蛋白水解酶家族，能广泛降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，在AS斑块形成和发展中发挥重要作用。其中有关MMP-2、MMP-9的研究是目前的热点，无论是糖尿病患者临床研究、糖尿病动物模型，还是高糖作用于体外培养的VSMCs都有显示MMP-2、MMP-9表达及活性的增加，可见MMPs在糖尿病大血管病变发生中起着重要作用，但是高糖激活MMPs发挥作用的分子机制尚不十分明确。
　　 白藜芦醇(resveratrol，Res)是近年来研究较多的一种植物抗毒素，具有广泛的生物和药理学作用，除具有抗炎、抗癌、抗氧化、抗衰老、抑制血小板聚集、调节脂质代谢、免疫调节等作用外，还可以通过抑制VSMCs的增殖迁移，发挥抗AS作用，从而对心血管起到保护作用。目前有关白藜芦醇能否通过调节MMP-2、MMP-9活性表达而达到抗AS作用的研究并不多，本研究通过应用白藜芦醇和PI3K特异性抑制剂Ly294002作用于高糖体外培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞，观察MMP-2、MMP-9表达和活性变化及p-Akt、Akt蛋白表达情况，探讨高糖引起MMPs表达及活性变化是否与PI3K信号通路有关，同时探讨白藜芦醇可能的作用机制，为糖尿病大血管病变早期防治提供新靶点，也为白藜芦醇的临床应用提供实验依据。
　　 实验方法:
　　 1、细胞培养:以大鼠胸主动脉平滑肌细胞株A7r5(细胞株购自中国培养物典藏中心)为研究对象。将冻存的血管平滑肌细胞株迅速投入37℃温水中，同时摇动冻存管使之快速解冻，解冻后800r/min离心5min，弃上清，加入含20％胎牛血清的DMEM培养液5ml混匀，接种于培养瓶中，放于37℃、5％CO2孵箱中孵育，待细胞铺满瓶底的90％后进行传代。取处于对数生长期的细胞分别接种于50ml培养瓶培养48h，更换于无血清DMEM培养基再培养24h后进行实验，分组如下:
　　 ①正常对照组(NG组，含5.5mmol/L葡萄糖)
　　 ②高糖培养组(HG组，含25mmol/L葡萄糖)
　　 ③NG+Ly294002组(10、20、30μmol/L)
　　 ④HG+Ly294002组(10、20、30μmol/L)
　　 ⑤NG+Res组(25、50、100μmol/L)
　　 ⑥HGRes组(25、50、100μmol/L)
　　 2、应用MTT法检测各组VSMCs增殖活性;
　　 3、应用免疫组化方法检测各组MMP-2、MMP-9表达;
　　 4、应用明胶酶谱法检测各组MMP-2、MMP-9活性;
　　 5、应用Westernblot技术检测各组p-Akt和总Akt蛋白表达，其中p-Akt表示活化的Akt。
　　 结果:
　　 1、用MTT法检测VSMCs的增殖活性，结果显示:HG组VSMCs增殖显著(0.513±0.007)，增殖活性明显高于NG组(0.357±0.009，P＜0.05)，HG+Ly294002组(10、20、30μmol/L)VSMCs增殖活性分别为0.421±0.016、0.402±0.017、0.373±0.022，HG+Res组(25、50、100μmol/L)增殖活性分别为0.474±0.023、0.438±0.031、0.386±0.013，二者均可明显抑制高糖诱导的VSMCs增殖(P＜0.05)，且均呈剂量依赖性;而NG+Ly294002组(10、20、30μmol/L)VSMCs增殖活性分别为0.382±0.010、0.382±0.013、0.382±0.012，NG+Res组(25、50、100μmol/L)VSMCs增殖活性分别为0.380±0.024、0.380±0.027、0.381±0.022，与NG组比较均无明显改变(P＞0.05）。
　　 2、用免疫组化方法检测VSMCs中MMP-2、MMP-9表达情况，结果显示:HG组MMP-2和MMP-9的表达分别为0.380±0.024、0.363±0.052，均较NG组明显升高(0.240±0.015、0.204±0.021，P＜0.05);HG+Ly294002组(10、20、30μmol/L)MMP-2的表达分别为0.323±0.044、0.282±0.026、0.248±0.013，MMP-9的表达分别为0.302±0.040、0.256±0.024、0.245±0.014，均较HG组明显降低(P＜0.05），且均呈剂量依赖性;HG+Res组(25、50、100μmol/L)MMP-2的表达分别为0.301±0.011、0.270±0.019、0.252±0.017，MMP-9的表达分别为0.322±0.030、0.280±0.019、0.247±0.009，均较HG组明显降低(P＜0.05），且呈剂量依赖性;除HG+Res(100μmol/L)MMP-2表达水平与NG组无差异外（P＞0.05），其余各组MMP-2和MMP-9表达水平仍高于NG组（P＜0.05）。
　　 3、用明胶酶谱法检测MMP-2及MMP-9活性变化，结果显示:HG组MMP-2和MMP-9的活性分别为8969.000±201.968、9339.667±128.469，均较NG组明显升高(2599.000±88.476、2677.667±146.302，P＜0.05);HG+Ly294002组(10、20、30μmol/L)MMP-2的活性分别为5962.667±211.316、4997.000±117.758、3792.333±137.012，MMP-9的活性分别为7574.333±101.041、6233.000±158.206、4741.667±80.432，均较HG组明显降低(P＜0.05)，且呈剂量依赖性，但仍高于NG组MMP-2、MMP-9的活性(P＜0.05);HG+Res组(25、50、100μmol/L)MMP-2的活性分别为7435.333±163.369、6209.667±195.372、5502.667±70.316,MMP-9的活性分别为8440.667±148.008、7889.333±155.828、6541.000±55.018，均较HG组明显降低(P＜0.05），且呈剂量依赖性，但仍高于NG组MMP-2、MMP-9的活性(P＜0.05）。
　　 4、用Westernblot技术检测p-Akt及总Akt蛋白表达情况，结果显示:NG组、HG组总Akt表达分别为0.701±0.013、0.705±0.015，两组之间无明显差异(P＞0.05);HG+Ly294002组(10、20、30μmol/L)总Akt表达分别为0.678±0.021、0.682±0.015、0.674±0.012，同NG组、HG组比较，无明显差异性(P＞0.05）;而HG+Res组(25、50、100μmol/L)总Akt的表达分别为0.530±0.016、0.534±0.016、0.532±0.017，同NG组、HG组比较有所降低(P＜0.05），但没有剂量依赖性;HG组的p-Akt表达为0.583±0.017，明显高于NG组(0.085±0.009，P＜0.05)，HG+Ly294002组(10、20、30μmol/L)p-Akt表达分别为0.404±0.017、0.244±0.016、0.126±0.017，HG+Res组(25、50、100μmol/L)p-Akt表达分别0.500±0.018、0.449±0.016、0.361±0.016，均低于HG组，说明二者均可明显抑制高糖诱导的p-Akt表达（P＜0.05），且呈剂量依赖性，但都仍高于NG组(P＜0.05）。
　　 结论:
　　 1、高糖通过激活PI3K/Akt信号通路，上调MMP-2和MMP-9的表达并增加二者活性，在VSMCs的增殖中可能发挥重要作用。
　　 2、白藜芦醇可能通过抑制高糖激活的PI3K/Akt信号通路，下调VSMCsMMP-2和MMP-9表达并降低其活性，减轻高糖引起的VSMCs增殖，并在一定范围内呈剂量依赖性。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

3 统计学处理

结果

1 白藜芦醇及P13K通路抑制剂Ly2940002对血管平滑肌细胞增殖活性的影响

2 白藜芦醇及P13K通路抑制剂Ly294002对VSMCs表达MMP-2及MMP-9的影响

3 白藜芦醇及P13K通路抑制剂Ly294002对MMP-2及MMP-9活性的影响

4 白藜芦醇及P13K通路抑制剂Ly294002对P-Akt及总Akt蛋白表达的影响

附图

附表

讨论

1 MMP-2，MMP-9在糖尿病大血管并发症发病中的作用

2 P13K／Akt信号通路在糖尿病大血管并发症发病中的作用

3 白藜芦醇在VSMCs增殖中的作用及可能机制

结论

参考文献

综述

致谢

个人简历