骨化三醇对UUO模型大鼠肾间质纤维化抑制作用及其对内皮细胞参与纤维化调控作用的研究

摘要

目的:通过观察骨化三醇对UUO大鼠肾间质纤维化抑制作用和内皮细胞TGF-β1、ICAM-1、HIF-1α、VEGF、VEGFR-2基因和蛋白水平表达的影响，从内皮细胞角度探讨骨化三醇对肾间质纤维化的抑制作用机制。
　　 方法:
　　 1、通过体内试验观察骨化三醇对UUO大鼠肾间质纤维化抑制作用。
　　 1.1、用180只清洁6周龄雄性SD大鼠，建立UUO模型。将动物分为五组（每组36只）:
　　 ①UUO空白对照组;
　　 ②手术对照组;
　　 ③UUO+骨化三醇高剂量组;
　　 ④UUO+骨化三醇低剂量组;
　　 ⑤UUO+贝那普利组。
　　 手术当天给药，每天给药1次，UUO+骨化三醇高、低剂量组分别给予骨化三醇6ng/100g、3ng/100g溶于1mL橄榄油灌胃，UUO+贝那普利组将盐酸贝那普利片0.17mg/100g溶于1mL生理盐水灌胃;UUO对照组将左侧输尿管结扎后缝合;手术对照组和UUO组每天仅用1mL生理盐水灌胃;并于第1、3、5、7、10、14天每组处死6只大鼠，留取标本。
　　 1.2、取梗阻侧肾脏采用HE染色法观察10，14天组肾组织病理变化，天狼腥红染色法观察14天组肾纤维化病理改变。
　　 1.3、ELISA法检测7，10，14天组大鼠血清TNF吨表达水平。
　　 1.4、采用RT-PCR和western blot法观察7，10，14天组转化生长因子(TGF-β1)、细胞间粘附分子-1（ICAM-1）mRNA和蛋白的表达。
　　 1.5、采用Western Blot法观察1，3，5天组血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR-2)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白的表达。
　　 2、通过细胞学试验探讨骨化三醇对内皮细胞参与纤维化病理变化的影响。
　　 2.1、内皮细胞的培养:
　　 人内皮细胞株(Eahy926)，用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基在37℃、5％ CO2、饱和湿度下培养，至Eahy926细胞生长成单层后备用。将Eahy926细胞分为5组:
　　 ①氯化钴刺激组;
　　 ②空白对照组;
　　 ③氯化钴+骨化三醇高剂量组（终浓度为10-8 mol/L）;
　　 ④氯化钴+骨化三醇中剂量组（终浓度为10-9 mol/L）;
　　 ⑤氯化钴+骨化三醇低剂量组（终浓度为10-10mol/L）。
　　 2.2、采用MTT法测定骨化三醇对氯化钴刺激的Eahy926细胞增殖作用的影响。
　　 2.3、采用ELISA法检测各组细胞培养上清液中VEGF表达水平。
　　 2.4、用RT-PCR、Western Blot法测定骨化三醇对Eahy926细胞的影响。RT-PCR法测定VEGF,VEGFR-2，HIF-1α和ICAM-1 mRNA表达水平，Western Blot法测定VEGFR-2，HIF-1α，ICAM-1蛋白的相对含量。
　　 2.5、采用流式细胞术检测各实验组内皮细胞凋亡率。
　　 3、数据资料用((x)±SD)表示。
　　 结果:
　　 1、骨化三醇对肾纤维化模型大鼠肾脏病理的改变的影响
　　 UUO术后，各时间点大鼠表现不同程度的梗阻侧肾脏肿大，肾皮质变薄，肾盂肾盏增大。手术对照组大鼠肾脏无明显改变，HE染色观察各UUO组显示肾小管间质中炎症细胞增多，肾小管细胞不同程度的变性、萎缩及坏死，骨化三醇高、低剂量组和贝那普利阳性对照组肾脏病变程度轻于同一时间点UUO组。天狼腥红染色观察UUO组大鼠肾间质胶原产生增多，各药物治疗组大鼠肾间质胶原减少，手术对照组大鼠肾间质胶原无明显增加。
　　 2、骨化三醇对UUO术后7，10，14天组大鼠血清TNF-α水平的影响
　　 各药物治疗组和UUO组TNF-α浓度较手术对照组升高(P＜0.05）。随着梗阻时间的延长，TNF-α的表达有上升的趋势，高低剂量骨化三醇和贝那普利可以降低UUO大鼠血清TNF-α的浓度（P＜0.05)。
　　 3、骨化三醇对UUO术后7，10，14天组大鼠肾组织TGF-β1，ICAM-1 mRNA和蛋白水平的影响
　　 各药物治疗组和UUO组TGF-β1，ICAM-1 mRNA和蛋白表达较手术对照组升高（P＜0.05），且随着梗阻时间的延长表达量上升，骨化三醇高低剂量和贝那普利可以明显降低同时间点UUO大鼠TGF-β1，ICAM-1蛋白和mRNA的表达(P＜0.05）。
　　 4、骨化三醇对UUO术后1，3，5天组大鼠肾组织HIF-1α，VEGF，VEGFR-2蛋白水平的影响
　　 4.1、骨化三醇对UUO术后1，3，5天组大鼠肾组织HIF-1α蛋白水平的影响
　　 各药物治疗组和UUO组HIF-1α蛋白表达较手术对照组升高（P＜0.05），且随着梗阻时间的延长保持相对稳定，骨化三醇高低剂量和贝那普利可以明显降低UUO大鼠HIF-1α蛋白的表达（P＜0.05）。
　　 4.2、骨化三醇对UUO术后1，3，5天组大鼠肾组织VEGF蛋白水平的影响
　　 骨化三醇高低剂量和贝那普利可以明显升高同时间点UUO大鼠VEGF蛋白的表达(P＜0.05)，但随着梗阻时间的延长表达有下降趋势。
　　 4.3、骨化三醇对UUO术后1，3，5天组大鼠肾组织VEGFR-2蛋白水平的影响
　　 各UUO组VEGFR-2蛋白表达较手术对照组升高不明显（P＞0.05）。骨化三醇高低剂量和贝那普利可以明显升高同时间点UUO大鼠VEGFR-2蛋白的表达（P＜0.05）。但随着梗阻时间的延长表达有下降趋势。
　　 5、不同浓度骨化三醇对氯化钴诱导的Eahy926细胞增殖的影响
　　 当骨化三醇终浓度升至10-9 mol/L，细胞生长增殖最明显，与氯化钴刺激组相比，差异有统计学意义(P＜0.05）。
　　 6、骨化三醇对氯化钴诱导的Eahy926细胞上清中VEGF的表达的影响
　　 各药物治疗组和氯化钴刺激组VEGF浓度较空白对照组升高（P＜0.05），骨化三醇各剂量组与氯化钴刺激组相比VEGF均升高(P＜0.05)，且当骨化三醇终浓度为10-9 mol/L时VEGF表达最明显。
　　 7、骨化三醇对氯化钴诱导的Eahy926细胞VEGF，HF-1α，VEGFR-2，ICAM-1，mRNA水平的影响
　　 氯化钴刺激组HIF-1α，ICAM-1 mRNA的表达较空白对照组升高(P＜0.05）。骨化三醇作用24h之后，Eahy926细胞中HIF-1α，ICAM-1的表达受到抑制，与氯化钴刺激组相比(P＜0.05））。而VEGF，VEGFR-2的表达较氯化钴刺激组升高（P＜0.05）。
　　 8、骨化三醇对氯化钴诱导的Eay926细胞产生VEGFR-2，HIF-1α，ICAM-1蛋白水平的影响
　　 氯化钴刺激组HIF-1α、ICAM-1蛋白表达与空白组相比明显升高(P＜0.05），VEGFR-2与空白对照组相比升高不明显（P＞0.05）。经过骨化三醇作用24h之后，各组HIF-1α、ICAM-1蛋白表达受到抑制，与氯化钴刺激组相比(P＜0.05）;而VEGFR-2蛋白的表达较氯化钴刺激组相比显著升高(P＜0.05）。
　　 9、不同剂量骨化三醇对经氯化钴诱导的Eahy926细胞凋亡的影响
　　 经氯化钴刺激24h后，氯化钴刺激组细胞凋亡率明显升高与空白对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05）。经过不同剂量骨化三醇作用24h之后，Eahy926细胞凋亡率明显下降，与氯化钴刺激组相比，差异有统计学意义(P＜0.05）。
　　 结论:
　　 1、骨化三醇具有抑制UUO大鼠肾间质纤维化的作用。
　　 2、骨化三醇对UUO大鼠肾间质纤维化的抑制作用可能与其上调UUO大鼠肾组织中 VEGF，VEGFR-2蛋白的表达，降低HIF-1α，ICAM-1，TGF-β1的表达有关，通过影响上述纤维化相关细胞因子的表达，减轻肾小管周围毛细血管的破坏，减少肾小管上皮细胞的转分化和成纤维细胞分泌细胞外基质，从而减轻肾间质纤维化。
　　 3、骨化三醇使氯化钴处理的Eahy926细胞VEGF，VEGFR-2表达升高，HIF-1α，ICAM-1表达下降（与骨化三醇对UUO大鼠纤维化肾组织中上述分子表达的影响一致），并显示能够降低内皮细胞凋亡率。提示骨化三醇可能通过影响内皮细胞纤维化相关细胞因子、受体及粘附分子表达，抑制局部炎症反应、保护肾脏毛细血管网及肾小管上皮细胞、间接减少局部TGF-β1水平，发挥抗肾间质纤维化作用。本结果揭示了骨化三醇通过内皮细胞途径发挥抗肾间质纤维化作用的部分机制。

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