DHA抑制2型糖尿病大鼠肝脏炎症改善胰岛素抵抗的机制研究

摘要

目的:DHA(docosahexaenoicacid，C22:6n-3)是体内重要的n-3系多不饱和脂肪酸。近些年研究发现DHA具有改善胰岛素抵抗(insulinresistance，IR)以及抑制炎症等作用，因此被用于预防及改善2型糖尿病(type2diabetes，T2D)，但其作用机制尚不完全清楚。
　　 肥胖诱导的慢性低度炎症与胰岛素抵抗之间的关系非常密切。许多研究证实，在细胞内TNFα、IL-1β、IL-6等促炎因子信号传导途径与胰岛素信号通路之间存在交叉，可以抑制胰岛素信号途径，导致胰岛素抵抗的发生。近年来的研究发现，DHA具有很强的抗炎能力，有研究结果显示，DHA通过抑制炎症反应而增加高脂饮食诱导的肥胖小鼠脂肪组织的胰岛素的敏感性。
　　 肝脏是参与体内糖脂代谢的重要器官，同时也是胰岛素抵抗发生的重要靶器官。与脂肪组织相比，在炎症发生时，肝脏除了炎症细胞侵润以外，其本身固有的巨噬细胞(Kupffercells)会被激活，从而加剧炎症反应。那么，DHA通过抑制炎症而改善2型糖尿病肝脏胰岛素抵抗的机制如何？
　　 因此，本课题用高脂饮食结合注射小剂量STZ的方法诱导肥胖2型糖尿病大鼠模型，通过饮食补充DHA，观察2型糖尿病大鼠肝脏胰岛素抵抗及炎症反应的改善情况，探讨DHA通过抗炎改善肝脏胰岛素抵抗的机制，为预防及治疗2型糖尿病及其并发症提供新的实验依据。
　　 方法:
　　 1.实验动物分组
　　 以本实验室侯连国等人制备的2型糖尿病大鼠以及饲喂DHA的2型糖尿病大鼠的肝脏为实验材料。实验动物分为对照(Con)组、2型糖尿病(T2D)组、T2D+DHA组。
　　 2.血清生化指标测定
　　 采用电子感应法，用雅培安妥超越血糖仪测定空腹血糖。采用放射免疫法测定空腹血清胰岛素。再通过计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和胰岛素敏感指数(HOMA-ISI)对大鼠整体胰岛素抵抗水平进行评估。
　　 3.肝组织糖原含量测定
　　 用南京建成肝组织糖原含量测定试剂盒，采用蒽酮法对肝组织中的糖原含量进行检测。
　　 4.QuantitativeRT-PCR检测目的基因mRNA表达水平
　　 用Promega公司总RNA提取试剂盒提取大鼠肝组织总RNA。以18SrRNA做内参，QuantitativeRT-PCR测定G6Pase、PEPCK、TNFa、IL-1β、IL-6、IL-10、Arg-1mRNA的相对表达量。
　　 5.Westernblot检测目的基因蛋白表达水平
　　 提取大鼠肝组织总蛋白，Westernblot测定TAK1、P-TAK1、JNK、P-JNK、AKT、P-AKT、GSK3β、P-GSK3β和PEPCK蛋白的相对表达量。
　　 6.肝组织HE染色
　　 对大鼠肝组织石蜡切片进行HE染色，观察肝组织的病理改变。
　　 7.数据处理
　　 实验数据采用SPSS16.0软件进行统计学分析，对测定结果进行正态性与方差齐性检验，数据用(x)±s表示，三组之间两两比较使用多个均数比较的方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果:
　　 1.DHA改善了2型糖尿病大鼠全身的胰岛素抵抗
　　 结果表明，2型糖尿病大鼠具有明显的胰岛素抵抗特征，饮食补充DHA虽然不能降低2型糖尿病大鼠的血糖及血清胰岛素水平，但可使2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗水平下降，胰岛素敏感性增加。
　　 2.DHA改善了2型糖尿病大鼠肝脏的炎症反应
　　 2.1.DHA对2型糖尿病大鼠肝脏炎症细胞浸润的影响
　　 对大鼠肝组织进行HE染色，观察肝组织的病理改变，结果表明，饮食补充DHA能使2型糖尿病大鼠肝组织中炎细胞浸润明显减少。
　　 2.2.DHA对2型糖尿病大鼠肝脏促炎因子TNFα、IL-1β、IL-6mRNA表达的影响
　　 结果表明，2型糖尿病大鼠肝组织中促炎因子TNFα、IL-1β、IL-6的mRNA表达显著增加，饮食补充DHA可使2型糖尿病大鼠肝组织促炎因子的表达显著减少。
　　 2.3.DHA对炎症信号通路中TAK1、JNK活性形式的影响
　　 结果表明，2型糖尿病大鼠肝组织中TAK1和JNK被激活，饮食补充DHA能抑制2型糖尿病大鼠肝组织中TAK1和JNK的活化。说明DHA对TNFα介导的“TNFα-TAK1-JNK”炎症信号通路有抑制作用。
　　 2.4.DHA对2型糖尿病大鼠肝脏抗炎因子IL-10、Arg-1mRNA表达的影响结果表明，2型糖尿病大鼠肝组织中抗炎因子IL-10、Arg-1的mRNA表达显著减少，饮食补充DHA可使2型糖尿病大鼠肝组织抗炎因子的表达增加。
　　 3.DHA改善了2型糖尿病大鼠肝脏的胰岛素抵抗
　　 3.1.DHA对肝糖原代谢的影响
　　 结果表明，2型糖尿病大鼠肝组织中GSK3β被激活，使糖原合酶磷酸化失活，使肝组织不能正常合成糖原，表现为糖原含量下降，而饮食补充DHA能抑制GSK3β的活化，使糖原合成增加。
　　 3.2.DHA对糖异生相关基因表达的影响
　　 结果表明，2型糖尿病大鼠肝组织糖异生的关键酶PEPCK和G6Pase的mRNA表达显著增强，使肝脏糖异生作用增强，而饮食补充DHA只能使2型糖尿病大鼠肝组织中PEPCK的mRNA及蛋白表达降低。
　　 3.3.DHA对胰岛素信号通路中AKT活性形式的影响
　　 结果表明，2型糖尿病大鼠肝组织中AKT活化被抑制，饮食补充DHA能使2型糖尿病大鼠肝组织中AKT活化。说明DHA可以通过减少TNFα的表达，抑制“TNFα-TAK1-JNK”信号通路，从而改善2型糖尿病大鼠肝脏的胰岛素抵抗。
　　 结论:
　　 1.DHA改善了2型糖尿病大鼠全身的胰岛素抵抗。
　　 2.DHA改善了2型糖尿病大鼠肝脏的胰岛素抵抗和炎症反应。
　　 3.DHA通过下调TNFα介导的“TNFα-TAK1-JNK”炎症信号通路，解除了对胰岛素“Ins/IRS-PI3K-AKT”信号的抑制，改善肥胖2型糖尿病肝脏的胰岛素抵抗。

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结论

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