siRNA抑制ZNF139对人胃癌裸鼠原位移植瘤细胞凋亡影响及机制研究

摘要

目的:胃癌是一种常见的恶性肿瘤，严重威胁着人类的健康。近年大量研究表明，锌指蛋白Krüppel家族中的许多成员可以通过调控凋亡相关基因的转录和表达，来介导肿瘤的发生和演进。ZNF139就属于Krüppel家族成员。本课题组前期研究表明:ZNF139在大多数胃癌中高表达，与胃癌的发生、发展密切相关。而ZNF139基因的表达与胃癌细胞凋亡及凋亡相关基因Bax、Bcl-2的表达是否有关尚无报道，有待于通过实验进一步证实。本实验利用重组质粒siRNA-ZNF139沉默人胃癌细胞SGC-7901裸鼠原位移植瘤中ZNF139基因的表达，以观察研究其对人胃癌裸鼠原位移植瘤细胞凋亡水平的影响，探讨ZNF139与胃癌细胞凋亡的关系及机制。
　　 方法:
　　 1.重组质粒siRNA-ZNF139及阴性对照质粒control-siRNA由天根生化科技有限公司设计合成，应用无内毒素质粒大提试剂盒提取重组质粒。抽提完毕后，所提取的质粒经紫外分光光度仪检测浓度和纯度。利用RT-PCR方法检测重组质粒siRNA-ZNF139的沉默效率。
　　 2.以人胃癌细胞株SGC-7901反复接种传代于BALB/C-(nu/nu)裸小鼠皮下形成的皮下移植瘤组织块为材料，将传代6次的组织块接种在裸小鼠胃壁浆膜层下，观察裸鼠的生存状态及移植瘤的生长情况。建立人胃癌细胞株SGC-7901裸鼠原位移植瘤动物模型。
　　 3.待肿瘤直径约5mm时，将其随机分为3组，空白对照组、阴性对照组和实验组，每组5只。1天、3天、5天、7天、9天，利用微量注射器分别将生理盐水50μl，control-siRNA20μg，重组质粒siRNA-ZNF13920μg注射入对应组的裸鼠原位移植瘤内。每天观察原位移植瘤的生长情况。
　　 4.在每次对瘤内进行注射前和处死裸鼠剥取原位移植瘤后测量移植瘤的最长径(A)及最短径(B)，根据公式:肿瘤体积(mm3)=1/2×A×B2，计算肿瘤的近似体积，并制作肿瘤的生长曲线。
　　 5.对裸鼠干预5次后，于第11天颈椎脱臼处死全部裸鼠，完整剥离瘤体，称取瘤重，以计算肿瘤抑制率，肿瘤抑制率=（对照组瘤重-实验组瘤重）/对照组瘤重×100％。
　　 6.处死裸鼠，完整剥离瘤体后，取少量新鲜瘤体标本，制作单细胞悬液，利用MTT法测定三组裸鼠胃癌细胞的存活率。
　　 7.通过流式细胞仪检测三组裸鼠胃癌细胞的凋亡率。
　　 8.利用RT-PCR方法测定三组裸鼠胃癌细胞中ZNF139、Bax、Bcl-2基因在mRNA水平的表达并进行比较。
　　 结果:
　　 1.ZNF139基因沉默效率的检测
　　 空白对照组ZNF139mRNA表达量(0.3586±0.0361)明显高于实验组(0.1237±0.0131)，差异具有统计学意义（P=0.00）。阴性对照组ZNF139mRNA表达量(0.3601±0.0296)明显高于实验组(0.1237±0.0131)，差异具有统计学意义(P=0.00)。沉默效率为65.7％。
　　 2.人胃癌细胞株SGC-7901裸鼠原位移植瘤模型的建立成功建立人胃癌细胞株SGC-7901裸鼠原位移植瘤模型，成瘤率100％(15/15)。
　　 3.重组质粒siRNA-ZNF139对人胃癌裸鼠原位移植瘤体的影响
　　 3.1移植瘤的生长情况
　　 空白对照组裸鼠肿瘤终体积(361.21±15.09)mm3明显大于实验组裸鼠肿瘤终体积(153.14±5.78)mm3，差异具有统计学意义(P=0.00)。阴性对照组裸鼠肿瘤终体积(354.09±9.79)mm3明显大于实验组裸鼠肿瘤终体积(153.14±5.78)mm3，差异具有统计学意义(P=0.00)。空白对照组与阴性对照组之间差异则无统计学意义(P=0.32)。与空白对照组和阴性对照组相比，实验组肿瘤体积生长速度明显减慢(Fig.5)，而阴性对照组肿瘤体积的生长速率略小于空白对照组。
　　 3.2重组质粒siRNA-ZNF139的抑瘤作用
　　 空白对照组裸鼠肿瘤的重量(2.41±0.13)g明显大于实验组裸鼠肿瘤的重量(1.11±0.06)g，差异具有统计学意义(P=0.00)。阴性对照组裸鼠肿瘤的重量(2.30±0.10)g明显大于实验组裸鼠肿瘤的重量(1.11±0.06)g，差异具有统计学意义(P=0.00)。空白对照组与阴性对照组之间差异则无统计学意义(P=0.11)。与空白对照组相比，实验组的抑瘤率为53.94％，而阴性对照组的抑瘤率仅为4.56％。
　　 4.重组质粒siRNA-ZNF139对人胃癌裸鼠原位移植肿瘤细胞存活率的影响
　　 空白对照组裸鼠胃癌细胞的吸光度值(0.5014±0.0487)明显高于实验组裸鼠胃癌细胞的吸光度值(0.2768±0.0048)，差异具有统计学意义(P=0.00)。阴性对照组裸鼠胃癌细胞的吸光度值(0.4926±0.0715)明显高于实验组裸鼠胃癌细胞的吸光度值(0.2768±0.0048)，差异具有统计学意义(P=0.01）。空白对照组与阴性对照组之间差异则无统计学意义(P=0.97)。
　　 5.重组质粒siRNA-ZNF139对人胃癌裸鼠原位移植肿瘤细胞凋亡的影响
　　 空白对照组裸鼠胃癌细胞的凋亡率(18.3800±4.6855)％明显低于实验组裸鼠胃癌细胞的凋亡率(33.3900±2.2393)％，差异具有统计学意义(P=0.00）。阴性对照组裸鼠胃癌细胞的凋亡率(16.9160±2.6913)％明显低于实验组裸鼠胃癌细胞的凋亡率(33.3900±2.2393)％，差异具有统计学意义(P=0.00）。空白对照组与阴性对照组之间差异则无统计学意义(P=0.51)。
　　 6.ZNF139、Bax、Bcl-2/mRNA在三组裸鼠胃癌组织中的表达情况
　　 6.1ZNF139mRNA的表达
　　 ZNF139在实验组裸鼠胃癌组织中的表达水平(0.1237±0.0131)明显低于空白对照组(0.3586±0.0361)，差异具有统计学意义(P=0.00)。ZNF139在实验组裸鼠胃癌组织中的表达水平(0.1237±0.0131)明显低于阴性对照组(0.3601±0.0296)，差异具有统计学意义(P=0.00)。空白对照组与阴性对照组之间差异则无统计学意义(P=0.93）。
　　 6.2BaxmRNA的表达
　　 Bax在实验组裸鼠胃癌组织中的表达水平(0.4981±0.0704)明显高于空白对照组(0.2036±0.0531)，差异具有统计学意义(P=0.00）。Bax在实验组裸鼠胃癌组织中的表达水平(0.4981±0.0704)明显高于阴性对照组(0.1981±0.0547)，差异具有统计学意义（P=0.00）。空白对照组与阴性对照组之间差异则无统计学意义(P=0.89）。
　　 6.3Bcl-2mRNA的表达
　　 Bcl-2在实验组裸鼠胃癌组织中的表达水平(0.0357±0.0039)明显低于空白对照组(0.1379±0.0366)，差异具有统计学意义(P=0.00)。Bcl-2在实验组裸鼠胃癌组织中的表达水平(0.0357±0.0039)明显低于阴性对照组(0.1437±0.0379)，差异具有统计学意义(P=0.00)。空白对照组与阴性对照组之间差异则无统计学意义(P=0.77)。
　　 结论:
　　 1.成功建立人胃癌组织块裸鼠原位移植瘤模型。
　　 2.应用重组质粒siRNA-ZNF139抑制ZNF139基因可以显著的抑制裸鼠原位移植瘤的生长，使其生长速度减慢，体积变小。
　　 3.重组质粒siRNA-ZNF139可以降低人胃癌裸鼠原位移植瘤细胞的存活率，有效促进胃癌细胞发生凋亡。
　　 4.重组质粒siRNA-ZNF139可以有效的降低人胃癌裸鼠原位移植肿瘤细胞中ZNF139基因的表达。降低ZNF139基因表达后，引起Bax基因的表达上调，Bcl-2基因的表达下调，进而诱导细胞凋亡，抑制肿瘤生长。

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结论

参考文献

综述

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