血必净对OVA诱导的变应性鼻炎小鼠的治疗作用及其对HO-1的影响

摘要

目的:
　　 变应性鼻炎(Allergicrhinitis，AR)是易感个体接触变应原后，主要由免疫球蛋白E介导的以发作性喷嚏、流涕和鼻塞为主要症状的鼻黏膜变态反应性炎症。表现为大量表达Th2细胞因子的Th细胞、嗜酸粒细胞和肥大细胞浸润，同时引发炎性反应过程[1]。近50年来变应性鼻炎的发病率呈逐年增高的趋势，作为难治性疾病，它已成为一个全球性健康问题。由于疾病发生的原因复杂且参与因素众多，因此以FVB小鼠为研究对象建立变应性鼻炎小鼠模型，以小鼠鼻黏膜下毛细血管内皮细胞为切入点研究血必净治疗前后鼻黏膜和毛细血管内皮中HO-1的表达情况，探讨血必净对OVA诱导的变应性鼻炎小鼠的治疗作用及其对HO-1的影响，为变应性鼻炎的治疗提供一个新的思路。
　　 方法:
　　 FVB系SPF级小鼠40只，随机分为正常对照组、OVA模型组、OVA+地塞米松干预组和OVA+血必净干预组，每组10只。OVA模型组:卵清蛋白(OVA)1.5ml加入氢氧化铝1.5ml，制成10％OVA混悬液。于实验第1～9天，经腹腔注射OVA混悬液250μl(OVA25μg)，基础致敏完成后于实验第10～17天行局部激发。OVA+地塞米松干预组、OVA+血必净干预组模型建立:实验第1～9天，经腹腔注射OVA混悬液250μl(OVA25μg)，基础致敏完成后，实验10～17天地塞米松(10mg/kg/d)或血必净(0.41ml/kg/d)腹腔注射预处理，30min后局部激发，建立模型。动物模型进行行为学观察。HE染色观察鼻部形态学改变。鼻腔灌洗液离心沉淀涂片行炎性细胞计数。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测外周血中OVA特异性IgE和鼻腔灌洗液IL-4、IL-5、IL-13、INF-γ水平。免疫组织化学染色观察鼻黏膜HO-1的表达情况。采用免疫磁珠技术对正常小鼠分离鼻黏膜下毛细血管内皮细胞，传代培养，培养于20％新生小牛血清的DMEM培养基，依照实验建立正常对照组、炎症模型组、血必净干预组、TNF+地塞米松干预组、TNF+血必净干预组、Znpp+TNF+血必净干预组。Westernblot、Real-timePCR技术检测毛细血管内皮细胞HO-1、ICAM-1表达情况，激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测ROS的表达。所有资料均运用SPSS13.0进行统计分析，采用方差分析和相关分析处理数据，以α=0.05作为检验标准，P＜0.05有统计学意义。
　　 结果:
　　 OVA模型组中10只动物均建模成功，变应性鼻炎典型症状明显;OVA+地塞米松干预组、OVA+血必净干预组相比正常对照组症状无明显变化。
　　 1、HE染色形态学观察:正常对照组鼻黏膜无明显炎症改变;OVA模型组鼻黏膜则有不同程度的水肿，上皮细胞结构紊乱，杯状细胞增生，黏膜下嗜酸粒细胞、中性粒细胞、单核细胞浸润;而OVA+地塞米松干预组、OVA+血必净干预组上述症状明显减轻。血清OVA特异性IgE水平ELISA检测:OVA模型组中的OVA特异性IgE水平相比正常对照组明显升高，而OVA+地塞米松干预组、OVA+血必净干预组相比OVA模型组明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05）;鼻腔灌洗液离心沉淀涂片行炎性细胞计数:OVA模型组中的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞相比正常对照组明显升高，而OVA+地塞米松干预组、OVA+血必净干预组相比OVA模型组明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05）。证明血必净对OVA诱导的变应性鼻炎小鼠有治疗作用。
　　 2、鼻腔灌洗液IL-4、IL-5、IL-13、INF-γ水平ELISA检测:OVA模型组中的IL-4、IL-5、IL-13水平相比正常对照组明显升高，而OVA+地塞米松干预组、OVA+血必净干预组相比OVA模型组明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05）;相反OVA模型组中的INF-γ相比正常对照组明显降低，而OVA+地塞米松干预组、OVA+血必净干预组相比OVA模型组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明血必净通过调节Th1/Th2失衡，从而治疗OVA诱导的变应性鼻炎小鼠。
　　 3、ROS与CAT、GSH、SOD的检测:ROS激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测显示:ROS在TNF+地塞米松干预组、TNF+血必净干预组相比炎症模型组在毛细血管内皮细胞明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。SOD、CAT、GSH在TNF+血必净干预组相比炎症模型组明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。说明血必净通过逆转氧化/抗氧化失衡，从而治疗OVA诱导的变应性鼻炎小鼠。
　　 4、Westernblot结果显示:相比炎症模型组，TNF+血必净干预毛细血管内皮细胞后，ICAM-1表达减少。单核细胞粘附:TNF+地塞米松干预组、TNF+血必净干预组相比炎症模型组毛细血管内皮细胞粘附单核细胞明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05）。说明血必净通过调节Th1/Th2失衡、逆转氧化/抗氧化失衡，抑制鼻黏膜下毛细血管内皮细胞活化，从而治疗OVA诱导的变应性鼻炎小鼠。
　　 5、免疫组化结果显示:OVA模型组鼠鼻黏膜中HO-1主要位于黏膜上皮细胞和腺上皮细胞的胞浆，少见于胞核，间质血管内皮细胞和浸润的炎细胞胞浆中也有阳性着色表达，阳性表达为棕黄色颗粒。OVA模型组、OVA+地塞米松干预组、OVA+血必净干预组与正常对照组相比，HO-1表达明显增高，差异有统计学意义(P＜0.05）。HO活力检测:血必净干预组、TNF+血必净干预组相比炎症模型组明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05）。Westernblot结果显示:血必净干预毛细血管内皮细胞后，HO-1表达呈现剂量依赖性和时间依赖性;TNF-α刺激毛细血管内皮细胞后，HO-1表达呈现先升高再降低(4h表达最强);而TNE+血必净干预毛细血管内皮细胞后，HO-1长时间高表达。相比炎症模型组，TNF+血必净干预毛细血管内皮细胞后，ICAM-1表达减少。Znpp是HO-1的阻断剂，Znpp阻断毛细血管内皮细胞HO-1后，ICAM-1表达仍明显增加。SOD、CAT、GSH在Znpp+TNF+血必净干预组相比TNF+血必净干预组明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。说明血必净通过诱导鼻黏膜下毛细血管内皮细胞HO-1的表达，其表达呈剂量依赖性和时间依赖性，调节Th1/Th2、氧化/抗氧化失衡，治疗OVA诱导的变应性鼻炎小鼠。
　　 结论:
　　 1、血必净对OVA诱导的变应性鼻炎小鼠的有治疗作用。
　　 2、血必净通过调节Th1/Th2、氧化/抗氧化失衡，抑制黏膜下毛细血管内皮活化，从而治疗OVA诱导的变应性鼻炎小鼠。
　　 3、血必净通过诱导鼻黏膜下毛细血管内皮细胞HO-1的表达，其表达呈剂量依赖性和时间依赖性，调节Th1/Th2、氧化/抗氧化失衡，治疗OVA诱导的变应性鼻炎小鼠。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 实验方法

3 统计学处理

结果

1 血必净对OVA诱导的变应性鼻炎小鼠的治疗作用

2 血必净对OVA诱导的变应性鼻炎小鼠Th1／Th2失衡的影响

3 血必净对OVA诱导的变应性鼻炎小鼠氧化／抗氧化失衡的影响

4 血必净对OVA诱导的变应性鼻炎小鼠黏膜下毛细血管内皮活化的影响

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 ROS在变应性炎症中的研究进展

致谢

个人简历