听觉剥夺动物模型的建立及BDNF/TrKB与听皮层可塑性的关系

摘要

目的:
　　 建立听觉剥夺（auditorydeprivation，AD）的动物模型，探索中枢听觉系统发生可塑性变化的相关分子机制。本实验研究了听觉剥夺动物模型中脑源性神经生长因子（brain-derivedneurotroficfactor，BDNF）及酪氨酸激酶受体B(tropomyosinreceptorkinaseB，TrkB)在听皮层内的表达变化，通过对听皮层神经元的形态及数量的动态观察，揭示BDNF/TrkB信号通路参与听皮层可塑性调节的重要作用，为耳聋患者接受电子耳蜗植入甚至脑干植入提供重要的参考价值。
　　 方法:
　　 选取2周龄健康雄性SD大鼠，5％水合氯醛（8ml/kg剂量）经腹腔注射麻醉，实验组行耳后切口双侧耳蜗损毁术，对照组行双侧耳后切口并且打开听泡，但不损毁耳蜗。采用听性脑干反应(auditorybrainstemresponse，ABR)测试装置，分别于术前和术后对实验组和对照组动物的听力阈值进行检测。分别于术后2周、4周、6周和8周四个时间点对动物进行心脏灌注，取出完整大脑浸入4％多聚甲醛后固定24小时，二次取材后经脱水、透明、浸蜡及包埋，制成石蜡标本;同时在与以上相同的四个时间点对动物进行眼球放血，断头处死，取双侧听皮层脑组织至Trizol溶液内保存于-80℃冰箱备用。利用苏木精-伊红（HemateinEosin，HE）染色及尼氏染色技术分别观察神经元形态和数量的变化，应用免疫组织化学方法和实时荧光定量聚合酶连反应技术分别检测BDNF和TrkB的基因和蛋白在听皮层内的表达变化。
　　 结果:
　　 1.动物模型的建立:通过耳后切口双侧耳蜗损毁术可以建立稳定可靠的听觉剥夺动物模型。术后2周对照组大鼠双耳平均听力阈值为20.21±4.29decibelsoundpressurelevel(dBSPL)，AD组双耳平均听力阂值为91.33±5.32dBSPL，两组间比较，差异具有显著统计学意义(P＜0.05)。
　　 2.HE染色结果:正常神经元体积较大，形态不规则，胞浆丰富呈深红色，细胞核大呈深蓝色，耳蜗损毁动物模型听皮层的神经元体积缩小，胞浆变得不丰富，核固缩，碎裂，甚至消失。
　　 3.尼氏染色和神经元计数结果:正常对照组神经元细胞体积较大，分布均匀，形态不规则，胞浆内Nissl小体近胞膜处明显。实验组可见神经元体积大小不一，分布杂乱，Nissal小体崩解，有的仅在细胞周边有少量残余。听觉剥夺导致听皮层神经元出现退化，随时间延长细胞数量逐渐减少，早期退化速度较慢，后期加快。除2周组和4周组比较无明显差异(P＞0.05)外，其余两两比较均有显著差异(P＜0.05)。各AD组与同期对照组比较神经元数量均减少，经t检验显示差异具有显著统计学意义(P＜0.05)。
　　 4.听皮层BDNF与TrkB蛋白表达变化:AD组及对照组听皮层均有BDNF与TrkB的阳性表达，表达定位在胞膜和轴突。耳蜗损毁术后听皮层BDNF与TrkB蛋白有相似的表达变化趋势，即术后2周降低，4周升高，之后又降低，峰值出现在术后4周。对照组听皮层BDNF与TrkB的表达在术后2周最多，之后下降并保持在一定水平。经方差分析显示，AD组各组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。各AD组与对照组比较，除6周组外，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。
　　 5.听皮层BDNF与TrkB基因mRNA的表达变化:AD组大鼠听皮层BDNF与TrkB的mRNA表达变化趋势基本一致:与对照组相比，2周组表达下降，4周增高，6周与对照组水平相当，之后下降。除6周组外，各AD组BDNF与TrkB的mRNA表达量与其对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 BDNF在正常大鼠听皮层内表达，出生后初期高表达，随着发育过程呈现下降趋势，TrkB作为BDNF的“功能受体”，呈现与BDNF相同的变化趋势;双侧耳蜗损毁的大鼠，BDNF及TrkB的表达量在初期下降之后上升，到后期再次减少，且两者的表达趋势呈正相关，听皮层内神经元的数量减少，早期较慢，后期加快。说明BDNF通过与功能性受体TrkB结合，参与听皮层神经元可塑性的调节，可能对神经元的损害具有代偿性修复作用。BDNF与TrkB可做为研究听皮层可塑性的重要指标。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

1．ABR检测结果

2．HE染色结果

3．尼氏染色及神经元计数

4．免疫组织化学结果

5．Real-Time PCR检测结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 脑源性神经生长因子与听觉中枢可塑性

致谢

个人简历