ADAMTS9基因甲基化检测对预测肝细胞癌发生及判断预后的价值

摘要

目的:肝细胞癌是较为常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率近年来有上升的趋势，但是肝细胞癌发病的分子机制尚未完全明确。随着表观遗传学研究的深入，抑癌基因启动子区域的异常甲基化在肿瘤发生及发展中的作用越来越受到人们的重视。ADAMTS（adisintegrinandmetallo-proteinasewiththrombospondinmotifs）称为带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解联蛋白金属蛋白酶家族，其基因家族的功能包括细胞外基质的溶解、止血过程，以及对血管生成的调节等。ADAMTS9是其家族成员之一，定位于染色体3p14.3-p21.1，是新发现的一个抑癌基因，既往研究表明在食管癌、鼻咽癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌中均发现ADAMTS9高甲基化。但是，ADAMTS9与肝细胞癌发生、发展的作用尚未见报道。本研究以肝癌细胞、新鲜肝组织及石蜡包埋组织为标本，检测ADAMTS9基因甲基化水平及基因蛋白表达，结合患者临床资料、病理学特征及生存期资料分析该基因在肝细胞癌发生、进展及预后评价中的意义。为抑癌基因ADAMTS9启动子区域甲基化检测在临床中的应用提供理论支持。
　　 方法:
　　 1、细胞培养及处理:肝癌细胞株Hep-G2按常规培养于RPMI-1640培养液中，肝癌细胞株SMMC-7721按常规培养于DMEM培养液中。两种细胞用含5-氮杂-2'脱氧胞苷(5-Aza-CdR)终浓度为10umol/L培养液培养24h，之后更换不含5-Aza-CdR的培养液，继续孵育72h。提取加药前后细胞株的DNA，进行甲基化特异性PCR(MethylationSpecificPCR,MSP)检测。
　　 2、研究对象及标本:2009年4月～2011年1月于河北医科大学第四医院肝胆外科行手术切除的肝细胞癌患者132例，其中男性113例，女性19例，年龄23～78岁，平均年龄54.29±9.78岁。肿瘤直径0.5～25cm。肝功能ChildA级123例，B+C级9例。132例患者中Ⅰ期40例，Ⅱ期76例，Ⅲ期15例，Ⅳ期1例。所有患者手术前后均未行其它辅助治疗。随访收集患者生存期资料。
　　 所有标本共279例，包括新鲜肝细胞癌组织标本132例及对应癌旁肝硬化组织132例，正常肝组织15例作为对照。标本常规石蜡包埋HE染色，2位病理学医师进行组织学诊断。其中高分化25例，中分化21例，低分化及未分化86例。
　　 3、ADAMTS9甲基化状态检测:甲基化特异性PCR(MethylationSpecificPCR,MSP)法检测132例新鲜肝细胞癌组织及对应癌旁肝硬化组织及15例正常组织DNA启动子区域的ADAMTS9甲基化状态。
　　 4、ADAMTS9基因蛋白表达检测:SP法检测76例肝细胞癌组织及相对应的癌旁肝硬化组织和10例正常肝组织中ADAMTS9蛋白的表达。
　　 5运用统计软件SPSS13.0统计学分析。计量资料采用t检验或非参数检验，计数资料采用X2检验或Fisher确切概率法，生存分析采用Kaplan-Meier法计算，单因素分析采用Log-rank检验，多因素分析采用COX模型。以P＜0.05认为具有统计学意义。
　　 结果:
　　 1、癌细胞及癌组织中ADAMTS9基因DNA甲基化状态
　　 ADAMTS9基因DNA甲基化状态有三种情况:一是完全甲基化状态;二是半甲基化状态;三是完全非甲基化状态。
　　 2、肝癌细胞处理前后生长状态观测及ADAMTS9基因甲基化状态检测
　　 2.1、细胞株生长状态观测
　　 加入5-Aza-CdR之前Hep-G2，SMMC-7721呈正常生长状态。加入5-Aza-CdR之后，细胞株呈现凋亡状态。
　　 2.2、ADAMTS9基因甲基化在两种细胞株中的检测
　　 5-Aza-CdR处理前肝癌细胞株Hep-G2，SMMC-7721的DNA用MSP检测可见ADAMTS9甲基化条带的出现。Hep-G2为完全甲基化状态，SMMC-7721为半甲基化状态。
　　 5-Aza-CdR处理后肝癌细胞株Hep-G2，SMMC-7721的DNA用MSP检测未检测到ADAMTS9甲基化状态，可见ADAMTS9非甲基化条带的出现。
　　 3、肝细胞癌组织中ADAMTS9基因甲基化状态及其与临床病理资料之间的关系
　　 3.1、肝细胞癌、癌旁肝硬化组织及正常组织中ADAMTS9基因启动子区域甲基化表达及比较
　　 132例肝细胞癌组织、癌旁肝硬化组织，15例正常组织中甲基化阳性率分别为66.67％(88/132)，29.55％(39/132)，0.0％(0/15)，三组间有明显的差别(X2=49.918，P=0.000)。癌组织的甲基化阳性率显著高于癌旁肝硬化组织(X2=36.431，P=0.000)及正常组织(X2=24.915，P=0.000)。
　　 3.2、肝细胞癌组织中ADAMTS9基因甲基化状态在患者不同临床病理特征间的比较
　　 ADAMTS9基因甲基化状态在性别(P=0.220)、年龄(P=0.175)、Child分级（P=0.717）、AFP值(P=0.428)、肿瘤大小(P=0.452)、肿瘤个数(P=0.869)、表面抗原(P=0.632)、有无转移(P=0.497)、分化程度(P=0.875)这些不同临床病理特征之间的差别无统计学意义(P均大于0.05)。有门脉瘤栓患者的甲基化阳性率(78.72％)大于无门脉瘤栓患者的甲基化阳性率(60.00％)，其差别有统计学意义(P=0.029)。Ⅰ～Ⅱ期肿瘤患者的甲基化阳性率高于Ⅲ～Ⅳ期肿瘤患者，差异有统计学意义(P=0.008)。
　　 4、肝细胞癌组织中ADAMTS9基因蛋白表达情况及其与临床病理资料之间的关系
　　 4.1、肝细胞癌组织中ADAMTS9基因蛋白表达情况
　　 76例肝细胞癌组织中，25例ADATMS9基因蛋白表达阳性，阳性表达率为32.89％，76例肝细胞癌旁肝硬化组织中54例ADATMS9基因蛋白表达阳性，阳性表达率为71.05％，10例正常肝组织中，9例ADATMS9基因蛋白表达阳性，阳性表达率为90％。三组之间的差异有统计学意义(P=0.000)，癌组织阳性率低于癌旁肝硬化组织(P=0.000)及正常组织的阳性率(P=0.001)。
　　 4.2、肝细胞癌组织中ADAMTS9蛋白表达在患者不同临床病理特征间的比较
　　 ADAMTS9蛋白表达在患者性别、年龄、Child分级、AFP值、肿瘤大小、有无门脉瘤栓、肿瘤个数、表面抗原情况之间的差异无统计学意义，P均大于0.05。但是在有无转移(P=0.041)、高分化患者与中低分化患者之间(P=0.003)，Ⅰ～Ⅱ期患者与Ⅲ～Ⅳ期患者相比(P=0.046)差异有统计学意义。
　　 5、ADAMTS9基因甲基化与蛋白表达的关系
　　 发生ADAMTS9基因启动子区域高甲基化肝细胞癌组织中ADATMS9蛋白的表达率为17.07％，ADAMTS9基因启动子区域甲基化阴性组的ADAMTS9蛋白表达率为48.64％，二者差异有统计学意义(P=0.036)。
　　 6、抑癌基因ADAMTS9DNA启动子区域的甲基化状态与肝细胞癌患者生存期预后的关系
　　 Kaplan-Meier法分析示ADAMTS9甲基化阳性患者的两年生存率为29.5％，中位生存时间为10个月，平均生存时间为12.50±0.93个月;阴性患者的两年生存率为50.0％，中位生存时间为23个月，平均生存时间为19.61±1.19个月，差异有统计学意义(P=0.002)。有转移患者的两年生存率为23.8％，无转移患者的两年生存率为42.2％，两者之间的差异有统计学意义(P=0.036)。为分析与肝细胞癌患者总生存期有关的独立预后因素，选择性别、年龄、Child分级、AFP值、肿瘤直径、有无门脉瘤栓、肿瘤个数、表面抗原情况、有无转移、分化程度、临床分期、有无甲基化12个变量进行COX多因素分析，结果显示抑癌基因ADAMTS9甲基化状态是预测肝细胞癌患者术后生存期预后的独立因素(P=0.013)，其余参数P值均大于0.05。
　　 结论:
　　 1、在正常组织、肝硬化、肝细胞癌组织中ADAMTS9基因甲基化发生率依次增高，说明ADAMTS9的启动子区域的异常甲基化可能参与了肝细胞癌的形成。
　　 2、ADAMTS9基因甲基化状态与有无门脉瘤栓形成及TNM分期有关，说明ADAMTS9甲基化状态在一定程度上反映了肝细胞癌的病情。
　　 3、抑癌基因ADAMTS9DNA启动子区域甲基化状态与肝细胞癌的预后相关，可作为预测术后肝细胞癌患者生存期预后的独立因子。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 肝癌细胞株培养及处理

2 研究对象及标本

3 主要实验仪器及试剂

4 DNA提取

5 DNA甲基化修饰—亚硫酸氢盐处理

6 甲基化特异性PCR(MSP)扩增过程

7 免疫组织化学检测

8 统计学处理

结果

1 癌细胞及癌组织中ADAMTS9基因DNA甲基化状态

2 肝癌细胞处理前后生长状态观测及ADAMTS9基因甲基化状态检测

3 肝细胞癌组织中ADAMTS9基因甲基化状态及其与临床病理资料之间的关系

4 肝细胞癌组织中ADAMTS9基因蛋白表达及其与临床病理资料之间的关系

5 ADAMTS9基因甲基化与蛋白表达的关系

6 抑癌基因ADAMTS9 DNA启动子区域的甲基化状态与肝细胞癌患者生存期预后的关系

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述

致谢

个人简历