醋酸甲羟孕酮对上皮性卵巢癌细胞上皮间质转化的影响及其作用机制研究

摘要

目的：
　　 上皮性卵巢癌(epithelialovariancancer,EOC)是妇科三大恶性肿瘤之一，其发病率仅次于宫颈癌、子宫内膜癌，位居第三。由于缺乏有效的早期筛查方法，绝大多数EOC患者在确诊时已达到FIGOⅢ或Ⅳ期，因此，EOC成为致死率最高的妇科恶性肿瘤，5年生存率仅30％。
　　 肿瘤侵袭转移是影响EOC患者生存率的主要因素，近年研究发现上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)在肿瘤的侵袭转移过程中起到重要作用。EMT是指在生理及病理情况下，如胚胎发育、伤口愈合、肿瘤转移级联反应的早期阶段等，发生细胞上皮-间质转变，同时伴随细胞形态与相关基因表达的改变。在EMT过程中，上皮细胞内TGF-β、Notch、Hedgehog、Wnt等信号通路发生不同程度活化;Snail相关锌指转录因子(Snail和Slug)等表达上调;上皮标志性蛋白E-cadherin等表达被抑制;进而上皮细胞失去其分化特征，包括细胞间的粘附、顶端-基底极性和无运动性，获得间质细胞的表型与功能，具备了运动、侵袭和增强的抗凋亡能力，从而在肿瘤的侵袭转移过程中起到重要作用。因此，研究EOC发生EMT的诱因及其调控机制，对于寻找针对肿瘤细胞转移的靶向治疗具有重要意义。
　　 尽管流行病学研究发现不孕，持续排卵等会促进EOC的发生发展，而多产，口服避孕药，哺乳，以及双胎妊娠会降低EOC的风险，提示孕激素在卵巢癌的发生过程中可能具有保护性作用，然而这一观点目前尚未定论。孕激素分为天然孕激素和人工合成孕激素两大类，人工合成孕激素又包括孕酮衍生物和睾酮衍生物两大类，不同种类的孕激素都具有转化子宫内膜和抑制下丘脑-垂体系统等共性，但因其化学结构、药代动力学、与甾体激素受体亲和性及作用效能、以及细胞内作用机制等方面均有所差异，故不同孕激素的药效均有所不同。其中第一代合成孕激素醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate，MPA)是17-羟孕酮的衍生物，是常用的避孕及激素治疗(HormoneTreatment，HT)药物。MPA不仅与孕激素受体(progesteronereceptor,PR)结合发挥孕激素样作用，还可与雄激素受体(androgenreceptor,AR)、糖皮质激素受体(glucocorticoidreceptor,GR)结合，以及活化部分细胞内信号转导通路，在靶器官发挥作用。研究发现，在EOC细胞表面可同时表达PR、AR、ER、GR等多种甾体激素受体，成为配体受体结合的基础。WHI关于雌孕激素替代治疗的研究结果引起了人们对孕激素安全性的重视。且RadhikaGogoi等研究发现MPA可通过与AR结合，可增强卵巢癌细胞OVCA429的侵袭能力。
　　 本实验通过体外培养上皮性卵巢癌细胞株SKOV3，观察MPA对SKOV3细胞转移能力以及细胞形态的影响;并进一步研究MPA作用于SKOV3细胞后，Snail、Slug转录因子以及E-cadherin蛋白的表达情况。探讨MPA能否通过诱导EOC细胞发生EMT，进而影响EOC细胞的转移能力。
　　 方法：
　　 将SKOV3细胞接种于含有10％胎牛血清、100U·ml-1青霉素、100U·ml-1链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37℃，饱和湿度、5％CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞用于实验，实验设立对照组(不含MPA)、MPA组(10-5mol/LMPA作用于SKOV3细胞48h或72h)。MPA作用前改用不含血清的无酚红RPMI-1640培养基饥饿处理两组细胞24h。实验分别重复3次。
　　 1、划痕实验观察SKOV3细胞的迁移能力:取对数生长期细胞，接种于培养板，待细胞生长融合为单细胞层。用0.2ml移液器枪头沿培养板底部中央划“一”字形划痕，用无菌PBS缓冲液洗涤，去除细胞碎片。按照实验分组加入含药培养液，各组均添加1％活性炭吸附的胎牛血清。分别于给药后0h、24h、48h显微镜下观测照相，每组至少拍摄照片(40×)6张，计算各组剩余划痕面积百分比。
　　 2、倒置显微镜观察SKOV3细胞的形态:将SKOV3细胞接种于放有盖玻片的培养皿中培养，取对数生长期细胞按照实验分组加入药物，定时倒置显微镜下观察细胞状态并照相。MPA作用72h后，将盖玻片取出，95％乙醇固定细胞，苏木素-伊红染色，在光学显微镜下拍照。
　　 3、RealTimePCR检测SKOV3细胞Snail、SlugmRNA表达水平:10-5mol/LMPA作用于SKOV3细胞48h后，提取对照组和MPA组细胞总RNA，按照invitrogen反转录试剂盒说明，合成cDNA。按照TakaraRealTimePCR反应体系加入SYBRgreenmix。采用MxProQPCR软件进行数据分析。实验重复3次，取均值。
　　 4、蛋白印迹法(Westernblot)检测SKOV3细胞E-cadherin蛋白、N-cadherin蛋白和vimentin蛋白的表达:10-5mol/LMPA作用于SKOV3细胞72h后，收集对照组和MPA组SKOV3细胞，并提取蛋白。分别检测E-cadherin蛋白、N-cadherin蛋白和vimentin蛋白的表达情况。
　　 5、应用SPSS13.0软件进行统计学处理。数据以(x)±s表示，各组均数的比较采用两独立样本t检验，P＜0.05具有统计学差异。
　　 结果：
　　 1、划痕实验观察MPA对SKOV3细胞迁移能力的影响:24h时，MPA组剩余划痕面积比率为（0.34±0.06）较对照组（0.51±0.05）明显减小，差异有统计学意义(P＜0.05)。48h时，MPA组划痕被迁移至中央的SKOV3细胞所覆盖，剩余划痕面积比率为（0.14±0.02）较对照组（0.46±0.06）明显减小，差异有统计差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 2、倒置显微镜观察SKOV3细胞形态的改变:对照组SKOV3细胞具有上皮样细胞特征，细胞形态呈立方形或椭圆形，细胞之间连接紧密，呈铺路石样排列，且具有克隆成片的能力。10-5mol/LMPA作用于SKOV3细胞72h后，可见细胞变为纺锤形，部分细胞伸出伪足，呈多角形，细胞间连接松散，细胞极性丢失，具备了间质样细胞特征。
　　 3、RealTimePCR检测Snail，SlugmRNA表达水平:10-5mol/LMPA作用于SKOV3细胞48小时后，Snail，SlugmRNA表达水平均显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 4、Westernblot检测各组E-Cadherin，N-Cadherin，Vimentin蛋白表达水平:10-5mol/LMPA作用于SKOV3细胞72小时后，可使上皮细胞标志物E-Cadherin蛋白表达水平明显减少（0.7±0.1），与对照组（1.1±0.2）相比，差异有统计学意义(P＜0.05);然而，10-5mol/LMPA作用于SKOV3细胞72小时可使间质细胞标记物N-Cadherin与vimentin蛋白表达水平则显著增加（1.4±0.3、0.9±0.2），与对照组（0.7±0.1、0.4±0.2）相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。
　　 结论：
　　 1、MPA可显著增强SKOV3细胞的迁移能力。
　　 2、MPA能够使SKOV3细胞由上皮形态改变为间质形态，发生EMT的形态学改变。
　　 3、MPA可上调SKOV3细胞Snail、SlugmRNA的表达水平。
　　 4、MPA可下调SKOV3的E-cadherin蛋白表达水平，上调N-cadherin、vimentin蛋白表达水平。
　　 5、MPA可以通过上调Snail、SlugmRNA的表达水平而抑制E-cadherin蛋白的表达，进而促使SKOV3细胞发生EMT，增强SKOV3细胞的迁移能力。

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