杂色曲霉素对体外培养人支气管上皮细胞(BEAS-2B)细胞周期影响的研究

摘要

目的:
　　 杂色曲霉素(Sterigmatocystin，ST)是曲霉菌属、青霉菌属和离蠕孢霉属产生的一种代谢产物。其污染非常广泛，普遍存在于谷物、玉米、豆类、香料和动物饲料中。除粮食作物和饲料外，ST在室内环境中的污染也比较常见。鉴于ST的致畸性、致突变性和致癌性，国际癌症研究中心已将其确认为“可能的人类致癌物”。动物实验发现，ST可以引起小鼠发生肺腺癌;体外实验发现，ST可以诱发人胚肺细胞发生恶性转化。提示ST具有致肺癌性。由于对应用人胚的顾忌，实验不能够继续进行。因此，对ST致肺癌机制的研究还远远不够。
　　 真核细胞通过复杂的细胞周期调控和凋亡系统来控制细胞的分裂增殖与死亡，从而维持机体的正常代谢和增殖。细胞周期调控失常时细胞会发生异常增殖，从而导致各种疾病的发生，甚至肿瘤的形成。当细胞发生DNA损伤后，细胞周期会停滞在某一时相为修复受损的DNA提供充足的时间，避免将该损伤遗传至子代细胞。体内和体外实验发现，很多真菌毒素（如T-2毒素、桔霉素、赭曲霉毒素等）对细胞的毒性作用均表现为可以诱导细胞发生周期阻滞。此外，我们近期研究发现，ST处理能诱导人胃粘膜上皮细胞(GES-1)和人食管粘膜上皮细胞(Het-1A)发生G2期阻滞。研究表明ST可以诱导体外培养人肺癌细胞(A549)发生DNA损伤，但ST对正常人肺上皮细胞DNA损伤、细胞周期分布及其可能机制的研究尚未见报道。
　　 鉴于此，为探讨ST与人类肺癌发生的可能机制之间的关系，本研究选取人永生化支气管上皮细胞(BEAS-2B)作为研究对象，观察不同浓度ST处理对BEAS-2B细胞DNA损伤、周期分布的影响并从分子角度初步分析其可能的机制，以揭示ST对正常人肺上皮细胞的毒性作用。
　　 方法:
　　 1、细胞培养
　　 正常人永生化支气管上皮细胞(BEAS-2B)培养于含有10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM/F12混合培养基中，37℃、5％CO2培养，细胞贴壁生长。
　　 2、噻唑蓝(MTT)比色法
　　 2.1、单细胞悬液制备及细胞计数
　　 取对数生长期的BEAS-2B细胞，用0.25％胰酶+0.02％EDTA常规消化，吹打混匀后取10μl滴于血细胞计数板上在显微镜下计数。计算公式为:细胞数（个细胞/ml）=（4个大格细胞总数/4）×104×稀释倍数。
　　 2.2、MTT比色法测定细胞存活率
　　 用新鲜培养基调整BEAS-2B单细胞悬液浓度，使其终浓度为1×104个细胞/ml，接种于96孔培养板内，每孔200μl。24h后吸掉上清液，加入低血清(1％)的DMEM/F12混合培养基，同步化处理24h后，更换新鲜的10％DMEM/F12混合培养基，同时给予ST，使其终浓度分别为0.06μM、0.15μM、0.3μM、0.6μM、1.5μM、3μM、6μM、12μM、24μM、48μM、96μM、192μM、240μM，溶剂对照组加入DMSO，每个浓度设6孔，继续培养。培养后24h每孔加入5mg/mlMTT20μl，继续培养4h，吸弃孔内上清，每孔加入150μlDMSO，充分振荡混匀，用多功能酶标仪测定各个孔在490nm处的OD值，并通过下列公式计算细胞存活率:细胞存活率(％)=（实验组OD490值/对照组OD490值）×100％。
　　 3、实验分组与处理
　　 根据MTT结果筛选出ST的最佳处理剂量，分别为6μM、12μM和24μM。取对数生长期的细胞，将其随机分为溶剂对照组和实验组。实验组给予ST处理，其终浓度分别为6、12和24μM，溶剂对照组给予等体积的DMSO处理，继续培养24h后常规消化，收集细胞，进行后续实验，检测相关指标。
　　 4、流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡与细胞周期分布
　　 ST处理24h后，分别收集溶剂对照组和各实验组细胞，PBS洗涤2次，1000rpm离心5min，收集细胞，70％冰乙醇固定后检测细胞周期的分布情况。
　　 5、蛋白免疫印迹法(Westernblot)
　　 不同浓度ST作用于BEAS-2B细胞24h后，分别提取细胞总蛋白，经BCA蛋白浓度测定试剂盒定量后，采用蛋白免疫印迹技术，检测ST处理后正常人支气管上皮细胞BEAS-2B中磷酸化型H2AX以及各细胞周期调控蛋白在蛋白水平的表达情况。
　　 6、统计
　　 所有实验至少重复3次，采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析（analysisofvariance，ANOVA），量效依赖关系采用双变量相关与回归分析，所有数据均用（x）±s表示，检验以P＜0.05为显著性差异标准。
　　 结果:
　　 1、ST可以抑制BEAS-2B细胞增殖
　　 本实验应用MTT评价不同浓度ST对BEAS-2B细胞增殖的影响。结果表明，ST对BEAS-2B细胞的生长有明显的抑制作用，经ST处理24h后12、24、48、96、192、240μMST处理组BEAS-2B细胞存活率均明显低于溶剂对照组，与浓度呈负相关关系（r=-0.91P＜0.05）。
　　 2、ST可以诱导体外培养BEAS-2B细胞DNA双链断裂
　　 γ-H2AX的蛋白分子量为14KD，经过SDS-PAGE电泳、转膜后，溶剂对照组和各实验组均在14KD的位置出现了阳性条带。以β-actin(42KD)为内参照，经定量分析后，结果显示，6、12和24μMST处理24h后，γ-H2AX的表达水平明显高于溶剂对照组并且随着ST浓度增加而升高。（r=0.914P＜0.05）。
　　 以上结果提示，ST处理能够诱导BEAS-2B细胞DNA双链断裂。
　　 3、ST可诱导体外培养BEAS-2B细胞发生细胞周期阻滞
　　 FCM结果显示，6μM和12μMST处理24h后，G0/G1期细胞比例减少，G2/M期细胞比例增多(P＜0.05)。24μMST处理24h后，G0/G1期细胞比例下降，而S期和G2/M期细胞比例均增加(P＜0.05)。
　　 以上结果提示，不同浓度的ST处理可以诱导BEAS-2B细胞发生不同的细胞周期阻滞。低浓度6μM和12μMST处理能诱导BEAS-2B细胞发生G2/M期阻滞，而高浓度24μMST处理则诱导其发生S期和G2/M期阻滞。
　　 4、ST对细胞周期关键调控因子的影响
　　 4.1、ST对G1期关键调控蛋白的影响
　　 4.1.1、ST可以上调CyclinD1的蛋白表达水平
　　 CyclinD1蛋白分子量为36KD，经过SDS-PAGE电泳、转膜后，溶剂对照组和各ST处理组均在36KD的位置出现了阳性条带。以β-actin(42KD)为内参照，经定量分析后，结果表明，不同浓度ST处理后CyclinD1的表达水平与溶剂对照组相比明显升高，与浓度呈正相关关系，差异具有显著性(r=0.992P＜0.05)。
　　 4.1.2、ST对CDK4蛋白表达水平无明显影响
　　 CDK4的蛋白分子量是34KD，经过SDS-PAGE电泳、转膜后，溶剂对照组和各实验组均在34KD的位置出现了阳性条带。以β-actin(42KD)作为内参照，经定量分析后，结果显示，各实验组CDK4的表达水平没有明显变化，与溶剂对照组相比差异无显著性(P＞0.05)。
　　 4.1.3、ST可以上调CyclinE1的蛋白表达水平
　　 CyclinE1的蛋白分子量是47KD，经过SDS-PAGE电泳、转膜后，溶剂对照组和各实验组均在47KD的位置出现了阳性条带。以β-actin(42KD)为内参照，经定量分析后，结果显示，与溶剂对照组相比，不同浓度ST处理后CyclinE1的表达水平明显升高(P＜0.05)。
　　 4.1.4、ST可以上调CDK2的蛋白表达水平
　　 CDK2的蛋白分子量是33KD，经过SDS-PAGE电泳、转膜后，溶剂对照组和各ST处理组均在33KD的位置出现了阳性条带。以β-actin(42KD)为内参照，经定量分析后，结果表明，不同浓度ST处理24h后，CDK2的表达水平明显高于溶剂对照组（P＜0.05）。
　　 综合以上结果表明，ST处理能上调BEAS-2B细胞G1期调控蛋白的表达水平。
　　 4.2、ST对S期和G2/M期关键调控蛋白的影响
　　 4.2.1、ST可以下调CyclinA的蛋白表达水平
　　 CyclinA的蛋白分子量是52KD，经过SDS-PAGE电泳、转膜后，溶剂对照组和各实验组均在52KD的位置出现了阳性条带。以β-actin(42KD)为内参照，经定量分析后，结果显示，除6μM处理组外，12μM和24μMST处理组BEAS-2B细胞中CyclinA的表达水平较溶剂对照组相比明显下降，与浓度呈负相关关系（r=-0.929P＜0.05）。与12μM处理组相比，24μMST处理后CyclinA的表达水平降低更明显(P＜0.05)。
　　 4.2.2、ST可以下调CDK1的蛋白表达水平
　　 CDK1的蛋白分子量为34KD，经过SDS-PAGE电泳、转膜后，溶剂对照组和各ST处理组均在34KD的位置出现了阳性条带。以β-actin(42KD)为内参照，经定量分析后，结果表明，与溶剂对照组相比，各ST处理组CDK1的表达水平随浓度增高而降低（r=-0.941P＜0.05）。
　　 4.2.3、ST可以上调CDK1的磷酸化水平
　　 磷酸化型CDK1的蛋白分子量也是34KD，经过SDS-PAGE电泳、转膜后，溶剂对照组和各实验组均在34KD的位置出现了阳性条带。以β-actin(42KD)为内参照，经定量分析后，结果显示，6μM、12μM和24μMST处理24h后，CDK1的磷酸化水平明显升高，与浓度呈正相关关系（r=1P＜0.05）。
　　 4.2.4、ST可以上调CyclinB1的蛋白表达水平
　　 CyclinB1的蛋白分子量是48KD，经过SDS-PAGE电泳、转膜后，溶剂对照组和各实验组均在48KD的位置出现了阳性条带。以β-actin(42KD)为内参照，经定量分析后，结果表明，与溶剂对照组相比，给予不同浓度ST作用24h后，CyclinB1的表达水平显著升高(P＜0.05)。
　　 综合以上结果提示ST处理可以诱导BEAS-2B细胞S期和G2/M期细胞周期调控因子发生不同的变化。
　　 结论:
　　 1、ST可以诱导BEAS-2B细胞发生DNA双链断裂。
　　 2、低浓度(6μM和12μM)ST处理能诱导BEAS-2B细胞发生G2/M期阻滞，而高浓度(24μM)ST处理则诱导其发生S期和G2/M期阻滞。
　　 3、不同浓度ST处理均可上调G1期调控蛋白(CyclinD1，CyclinE1和CDK2)的表达，从而促进细胞由G1期进入S期。
　　 4、12和24μMST处理可以下调CyclinA的表达，提示细胞通过S期的过程可能会延迟，最终发生S期阻滞。
　　 5、不同浓度ST处理可以下调CDK1的表达，而上调CyclinB1的表达和CDK1的磷酸化水平。这可能与ST诱导细胞发生G2/M期阻滞有关。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

1 ST可以抑制BEAS-2B细胞增殖

2 ST可以诱导体外培养BEAS-2B细胞DNA双链断裂

3 ST可诱导体外培养BEAS-2B细胞发生细胞周期阻滞

4 ST对细胞周期关键调控因子的影响

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 细胞周期蛋白与肿瘤的研究

致谢

个人简历