阿仑膦酸钠对卵巢切除大鼠腰椎间盘退变的作用及其机制的研究

摘要

腰椎间盘退变是导致下腰部疼痛的主要病因之一，下腰痛给患者带来巨大痛苦的同时，给家庭及社会带来沉重的经济负担。一些临床及流行病学研究认为，骨质疏松与脊柱退行性疾病或椎间盘退变呈负相关性，但最近的一项关于绝经期前后妇女椎体骨密度与腰椎间盘退变相关性的研究显示，腰椎骨密度与腰椎间盘退变呈正相关性，跟骨及桡骨的骨密度同样与椎间盘退变密切相关。此外，在前期研究中发现卵巢切除大鼠腰椎间盘退变与椎体骨量丢失密切相关，提示对骨质疏松的治疗可能会对椎间盘退变进程发挥一定的作用。骨质疏松与椎间盘退变关系仍存在争议，因此两者之间的关系还有待进一步研究。
　　 研究显示，椎间盘退变与脊柱结构完整有关，包括邻近的结构如椎体及终板。椎体及终板结构的破坏将导致异常力学负荷作用于椎间盘。对绝经期前后妇女骨密度变化的研究结果显示，骨密度与椎间盘的高度存在一定的相关性，说明椎体的结构特性与椎间盘退变程度密切相关，并且组织结构的改变同样会影响到其它结构进而出现改变。骨密度降低所引起的椎体骨折可导致椎间盘高度降低，并加速椎间盘的退变进程。软骨终板不仅是维持椎间盘正常功能的重要结构，同时还是髓核获取营养的重要途径。Nachemson等人发现，软骨终板钙化会导致软骨终板增厚，软骨终板内软骨层变薄，从而影响营养物质通过软骨终板向椎间盘的扩散，最终导致椎间盘早期出现退行性变。
　　 雌激素缺乏可引起绝经后妇女终板出现退行性改变，进而最终导致椎间盘发生退行性变。雌激素替代治疗被建议用于骨质疏松相关的椎间盘退变的治疗。然而，患者因雌激素治疗尚存在一些不良反应而拒绝用药，因此，当前迫切需要一种新的药物用于骨质疏松相关的椎间盘退变的治疗，如二膦酸盐类药物:阿仑膦酸钠、唑来膦酸钠等。阿仑膦酸钠作为一种潜在的二膦酸盐类药物，已广泛用于绝经后妇女骨质疏松的治疗。阿仑膦酸钠可提高患者骨密度，抑制骨转换率，降低骨折发生率。最近，Neogi等人的研究显示，阿仑膦酸钠可以抑制绝经后妇女椎间隙变窄，提示二膦酸盐类药物对椎间盘退变具有一定作用。阿仑膦酸钠对椎间盘退变的作用机制尚不清楚，因此本研究拟通过影像学、组织形态计量学、分子生物学等方法，探讨阿仑膦酸钠对卵巢切除大鼠腰椎间盘退变的作用及其相关作用机制，为临床治疗骨质疏松相关的腰椎间盘退变提供理论依据及临床用药指导。
　　 第一部分卵巢切除大鼠椎体骨量丢失与腰椎间盘退变关系的实验研究
　　 目的:探讨卵巢切除大鼠椎体骨量丢失与大鼠腰椎间盘退变的关系。
　　 方法:20只3月龄雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为两组:假手术组（Sham）及卵巢切除组(OVX)。Sham组大鼠进行假手术，仅暴露卵巢组织但不切除。OVX组大鼠经卵巢切除术切除双侧卵巢组织，卵巢切除术后6个月，采用过量失血方法处死各组大鼠并收集L3-6节段及其椎间盘组织。椎体骨密度检测及椎体骨组织形态计量学检测用以评价大鼠椎体骨量及椎体微观结构的变化。对椎间盘进行van Gieson染色进行椎间盘组织学观察并进行组织学评分。
　　 结果:
　　 1、骨密度检测结果
　　 OVX组大鼠L3-6椎体BMD显著低于Sham组（P＜0.05）。
　　 2、椎体骨组织形态计量学检测结果
　　 OVX组大鼠L4椎体骨小梁相对体积(BV/TV)，骨小梁厚度(Tb.Th)及骨小梁数量(Tb.N)显著低于Sham组（P＜0.05），而骨小梁分离度(Tb.Sp)，荧光周长百分率(％L.Pm)，矿化沉积率(MAR)及骨形成率（BFR/BV）显著高于Sham组（P＜0.05）。
　　 3、组织形态学观察及组织学评分结果
　　 OVX组大鼠椎间盘髓核内脊索细胞大量减少，软骨样细胞大量增殖，并可见粘液样变性。软骨终板可见大量骨样组织及髓腔生成。OVX组椎间盘组织学评分显著高于Sham组（P＜0.05）。
　　 第二部分阿仑膦酸钠对卵巢切除大鼠腰椎间盘退变的预防作用的实验研究
　　 目的:本研究旨在应用骨质疏松大鼠模型探讨预防性应用阿仑膦酸钠对腰椎间盘退变的作用。
　　 方法:30只3月龄雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机等分为三组:
　　 (1)假手术组(Sham);
　　 (2)卵巢切除+盐水组(OVX+V);
　　 (3)卵巢切除+阿仑膦酸钠组(OVX+ALN)。
　　 Sham组大鼠进行假手术，仅暴露卵巢组织但不切除。OVX+V组及OVX+ALN组大鼠经卵巢切除术切除双侧卵巢组织后，OVX+ALN组大鼠给予阿仑膦酸钠颈后皮下注射，剂量为15μg/kg，一周两次。OVX+V组大鼠给予等体积的生理盐水作为对照。卵巢切除术后6个月，采用过量失血方法处死各组大鼠并收集L3-6节段椎体及其间盘组织。椎体骨密度检测、micro-CT检测及椎体生物力学检测用以评价大鼠腰椎椎体骨组织特性及微观结构的变化。对椎间盘进行van Gieson染色进行椎间盘组织学观察并进行组织学评分。同时对各组大鼠椎间盘高度以及软骨终板厚度的变化进行分析比较。免疫组织化学染色及real-time PCR用于检测各组大鼠椎间盘中aggrecan、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、MMP-1、MMP-3及MMP-13表达的变化。
　　 结果:
　　 1、椎体骨密度检测结果
　　 OVX+V组大鼠L3-4及L5-6椎体BMD显著低于Sham组(P＜0.05)。OVX+ALN组大鼠L3-4及L5-6椎体BMD显著高于OVX+V组（P＜0.05）
　　 2、Micro-CT检测结果
　　 OVX+V组BV/TV、Tb.N显著低于Sham组，而Tb.Sp及SMI显著高于Sham组（P＜0.05）。OVX+ALN组椎体BV/TV、Tb.N显著高于OVX+V组，Tb.Sp及SMI显著低于OVX+V组（P＜0.05）。而Tb.Th在三组间无统计学差异（P＞0.05）。
　　 3、椎体生物力学检测结果
　　 OVX+V组椎体极限负荷(maximum load)，屈服应力(yield stress)，极限应力(maximum stress)及弹性模量(elastic modulus)均显著性低于Sham组(P＜0.05)。OVX+ALN组椎体极限负荷，屈服应力，极限应力及弹性模量均显著高于OVX+V组（P＜0.05）。
　　 4、组织形态学观察及组织学评分结果
　　 OVX+V组椎间盘退变明显，而OVX+ALN组椎间盘髓核内仅出现少量的软骨样细胞，髓核未见粘液样变性，在纤维环与髓核交接处可见纤维软骨增殖现象。软骨终板内可见大量异常骨样组织及髓腔生成。而OVX+ALN组椎间盘退变程度较轻，仅在髓核内出现少量的软骨样细胞增殖，以及在髓核与纤维环交界处出现一些软骨细胞增殖，髓核内未出现粘液样变性。并且在软骨终板中段未发现有异常骨样组织生成。OVX+V组L5-6椎间盘组织学评分显著高于Sham组，而OVX+ALN组组织学评分显著低于OVX+V组(P＜0.05)。
　　 5、椎间盘高度检测结果
　　 OVX+V组L5-6椎间盘高度显著低于Sham组(P＜0.05)，OVX+ALN组L5-6椎间盘高度显著高于OVX+V组（P＜0.05），OVX+ALN组与Sham组L5-6椎间盘高度无显著性差异（P＞0.05）。
　　 6、软骨终板厚度及软骨终板内骨样组织面积检测结果
　　 OVX+V组软骨终板厚度及软骨终板内骨样组织与软骨终板面积比值均显著高于Sham组(P＜0.05)，OVX+ALN组大鼠软骨终板厚度显著低于OVX+V组（P＜0.05），且软骨终板内骨样组织与软骨终板面积比值显著低于OVX+V组(P＜0.05)。
　　 7、椎间盘免疫组织化学检测结果
　　 OVX+V组髓核内，aggrecan及Ⅱ型胶原染色强度显著低于Sham组。然而，OVX+ALN组aggrecan及Ⅱ型胶原染色强度显著高于OVX+V组。OVX+V组髓核内MMP-1、MMP-3及MMP-13染色强度显著高于Sham组，而OVX+ALN组髓核内MMP-1、MMP-3及MMP-13染色强度显著低于OVX+V组。
　　 OVX+V组纤维环中MMP-1、MMP-3及MMP-13表达增高，其IOD值显著高于Sham组（P＜0.05）。但OVX+ALN组纤维环中MMP-1、MMP-3和MMP-13的表达显著降低，其IOD值显著低于OVX+V组（P＜0.05）。
　　 OVX+V组纤维环中Ⅰ型胶原表达增高及Ⅱ型胶原表达降低，其IOD值显著高于或低于Sham组（P＜0.05）。而OVX+ALN组纤维环中Ⅰ型胶原表达降低及Ⅱ型胶原表达增强，其IOD值显著低于或高于OVX+V组(P＜0.05)。OVX+V组软骨终板区域可见X型胶原免疫组织化学染色程度强于Sham组，而OVX+ALN组X型胶原染色强度低于OVX+V组。
　　 8、Real-time PCR检测结果
　　 与Sham组相比，OVX+V组Col2α1 mRNA表达降低（P＞0.05），而aggrecan及Col1α1 mRNA表达显著增高（P＜0.05）。而OVX+ALN组aggrecan及Col2α1 mRNA显著高于OVX+V组（P＜0.05），Col1α1 mRNA表达显著低于OVX+V组(P＜0.05)。OVX+V组MMP-1、MMP-3及MMP-13mRNA表达显著高于Sham组(P＜0.05)。而阿仑膦酸钠可有效抑制由卵巢切除引起的MMP-1、MMP-3及MMP-13 mRNA表达的增高(P＜0.05)。
　　 第三部分阿仑膦酸钠治疗卵巢切除大鼠腰椎间盘退变作用效果的实验研究
　　 目的:探讨阿仑膦酸钠对卵巢切除大鼠腰椎间盘退变的治疗作用。
　　 方法:30只3月龄雌性SD大鼠随机分为三组:(1)假手术组（Sham）;(2)卵巢切除+盐水治疗组(OVX+V);(3)卵巢切除+可仑膦酸钠治疗组(OVX+ALN)。OVX+V组及OVX+ALN组大鼠行双侧卵巢切除术切除双侧卵巢组织，Sham组大鼠仅暴露卵巢组织但不切除。OVX+ALN组大鼠于卵巢切除术3个月后给予阿仑膦酸钠颈后皮下注射，剂量为15μg/kg，一周两次。OVX+V组大鼠给予等体积的生理盐水作为对照。卵巢切除术后6个月，过量失血处死各组大鼠并收集L3-6椎体标本。椎体骨密度检测及Micro-CT检测用以评价大鼠腰椎椎体骨骼特性及微观结构的变化。应用van Gieson染色进行椎间盘组织学检测及组织学评分。免疫组织化学染色用于检测各组大鼠椎间盘中aggrecan、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、MMP-1及MMP-13表达的变化。
　　 结果:
　　 1、椎体BMD检测结果
　　 OVX+V组大鼠L3-4及L5-6椎体BMD显著低于Sham组(P＜0.05)，而OVX+ALN组大鼠L3-4及L5-6椎体BMD显著高于OVX+V组（P＜0.05）。
　　 2、Micro-CT检测结果
　　 OVX+V组BV/TV、Tb.N显著低于Sham组，而Tb.Sp显著高于Sham组（P＜0.05）。而OVX+ALN组椎体BV/TV、Tb.Th显著高于OVX+V组，Tb.Sp显著低于OVX+V组（P＜0.05）。
　　 3、椎间盘组织形态学观察及评分结果
　　 OVX+V组髓核内，脊索细胞数量显著减少，并出现大量软骨样细胞增殖，髓核内可见粘液样变性。在纤维环与髓核的过渡区出现大量体积较小的软骨细胞增殖。软骨终板内异常钙化现象较为明显，并且在软骨终板的中段出现大量的异位骨样组织及髓腔。OVX+ALN组髓核内脊索细胞数量未出现显著性减少，髓核中出现一定量的软骨样细胞，并出现轻度的黏液样变性。在纤维环与髓核交接处可见纤维软骨细胞增殖现象。
　　 OVX+V组椎间盘组织学评分显著高于Sham组（P＜0.05），而OVX+ALN组椎间盘组织学评分显著低于OVX+V组（P＜0.05），但Sham组与OVX+ALN组椎间盘组织学评分无显著性差异（P＞0.05）。
　　 4、免疫组织化学染色结果
　　 OVX+V组髓核内aggrecan及Ⅱ型胶原表达较Sham组显著降低，MMP-1及MMP-13表达增强，而OVX+ALN组aggrecan及Ⅱ型胶原表达高于OVX+V组，并且MMP-1及MMP-13表达弱于OVX+V组。OVX+V组纤维环中MMP-1及MMP-13表达增高，其IOD值显著高于Sham组(P＜0.05)。但OVX+ALN组纤维环中MMP-1和MMP-13的表达显著降低，其IOD值显著低于OVX+V组（P＜0.05）。
　　 OVX+V组纤维环中Ⅱ型胶原表达降低，而Ⅰ型胶原表达增高，其IOD值分别显著低于或高于Sham组（P＜0.05）。而OVX+ALN组纤维环中Ⅱ型胶原表达增强，Ⅰ型胶原表达减弱，其IOD值显著高于或低于OVX+V组（P＜0.05）。
　　 OVX+V组软骨终板内X型胶原表达显著高于Sham组，而OVX+ALN组软骨终板内X型胶原表达较OVX+V组显著降低。
　　 结论:
　　 1、卵巢切除大鼠椎体发生骨质疏松同时可合并出现腰椎间盘的退行性改变。
　　 2、阿仑膦酸钠可有效延缓卵巢切除大鼠腰椎间盘退变进程。其具体作用机制一方面可能与维持椎体及软骨终板结构的完整性及功能有关，另一方面与调控细胞外基质代谢，保护椎间盘的功能有关。
　　 3、阿仑膦酸钠是一种防治与骨质疏松相关的腰椎间盘退变的潜在性药物。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 骨质疏松与腰椎间盘退变关系的实验研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 阿仑膦酸钠对卵巢切除大鼠腰椎间盘退变的预防作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 阿仑膦酸钠对卵巢切除大鼠腰椎间盘退变治疗作用的实验研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述

致谢

个人简历