氧化应激和慢性炎症影响睾丸间质细胞衰老的作用机制研究

摘要

血清睾酮含量下降是人类和啮齿类动物雄性衰老的主要表现，并出现生殖功能、肌力、骨密度以及其他生理指标的下降。睾酮主要是在腺垂体分泌的黄体生成素(luteinizinghormone，LH)刺激下由睾丸间质细胞合成分泌的。尽管血清睾酮水平下降应与下丘脑-垂体轴功能改变有关，但是血清LH水平随年龄的增加并没有明显改变，故初级性腺成了研究焦点。对年轻和老年大鼠睾丸间质细胞计数表明损失的睾丸间质细胞并不能解释年龄有关的睾酮水平降低，因此睾丸间质细胞功能的变化与之关系更密切。
　　 近年来，氧化应激一直备受关注。“自由基学说”认为衰老的细胞处于一种氧化和抗氧化失衡状态，无法清除体内多余的活性氧(reactiveoxygenspeciesROS)，导致细胞内大分子物质的氧化损伤，包括细胞膜脂类物质的过氧化、酶失活、蛋白质氧化和DNA损伤，同时衰老的机体也形成了一套氧化应激应答系统来应对自由基。抗氧化酶在保护细胞免受自由基损伤中扮演重要角色。核因子NF-E2相关因子(Nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2，Nrf2)可通过与抗氧化反应元件(antioxidantresponsiveelement，ARE)的相互作用来调节抗氧化酶的转录，是迄今为止发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路。慢性炎症也是衰老器官生理功能下降的一个重要因素。NF-κB(Nuclearfactorkappabeta，NF-κB)作为一个氧化还原状态敏感的转录因子蛋白家族成员之一，可调控促炎症因子的表达，包括:TNF-α、IL-1β、IL-2、iNOS、COX2等。在衰老过程中，NF-κB转录因子的激活和慢性炎症似乎成了一个普遍现象。
　　 本研究旨在利用功能学、形态学和分子生物学等方法，从睾丸组织、间质细胞两个水平，以血清睾酮的年龄性下降为着眼点，探讨Nrf2抗氧化应激通路以及NF-κB慢性炎症通路在睾酮下降过程中的作用机制。研究分为以下三个部分:(1)在小鼠睾丸组织中，检测了Nrf2和NF-κB两条通路的年龄性变化。(2)分离培养原代衰老睾丸间质细胞，证实ROS→p38MAPK→COX2、NF-κB→COX2和Nrf2信号通路与睾酮下降是密切相关的。(3)确定生命不同阶段的适度运动在年龄性睾丸生理功能下降过程中的不同作用。
　　 第一部分，SAMs小鼠睾丸组织氧化应激和炎症反应的加龄变化及Nrf2和NF-κB在此过程中的作用
　　 目的:
　　 雄性体内年龄性血睾酮水平下降，导致机体生理功能下降。但是睾酮下降的具体机制还不清楚。本研究中，我们探讨了SAMP8(senescence-acceleratedmouse8)和其对照SAMR1雄性小鼠血睾酮水平年龄性（2，4，8，10月龄）下降过程中，氧化应激和炎症反应的变化，并检测了Nrf2和NF-κB信号通路在此过程中的作用。
　　 方法:
　　 1、实验动物:选用2，4，8，10月龄的雄性SAMP8和SAMR1小鼠，由河北医科大学第一医院提供，每组6只。
　　 2、睾酮测定:RIA法测定血清睾酮水平，批内和批间差异系数分别为8.9％和13.6％。
　　 3、免疫组化和免疫组织荧光方法检测睾丸组织COX2、Nrf2、NF-κB的表达变化。
　　 4、生化学检测MDA和蛋白羰基的水平以及抗氧化酶SOD、CAT和GPX活性变化。
　　 5、Luminex多重细胞因子轮廓分析技术检测促炎症因子TNF-α，IL-1β的水平变化。
　　 6、RT-PCR和Westernblotting检测StAR、Nrf2、NF-κB、COX2、P450scc、P-P38和P38蛋白和mRNA水平的表达变化。
　　 7、数据分析:用SPSS16.0统计软件进行统计学分析，所有数据以x±s表示。年龄和种属间资料应用双因素方差分析。其次，同一种属内不同月龄资料采用单因素方差分析;同一月龄不同种属间的资料应用T-检验分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果:
　　 1、年龄依赖的血睾酮水平变化:种属和年龄间有交互作用(p=0.000)。2、4、8和10月龄P8鼠血清睾酮水平依次下降，其中4月龄P8鼠睾酮水平明显高于8、10月龄(p＜0.01），8月龄P8鼠的睾酮水平较4月龄降低了大约44％，然而R1鼠的4月龄和8月龄睾酮水平没有明显变化。
　　 2、年龄依赖的StAR和P450scc的表达变化:StAR的表达在种属和年龄间有交互作用，而P450scc的表达在种属和年龄间没有交互作用。StAR和P450scc的表达随年龄增加逐渐下降。8月龄P8鼠StAR表达明显下降(p＜0.01），而R1鼠4月龄和8月龄StAR表达没有差异。较R1相比，2、4月龄P8鼠StAR表达明显增加，而8、10月龄明显降低(p＜0.05）。P8鼠的前三个月龄P450scc表达没有差异，但是10月龄较前三组明显下降。10月龄P8鼠P450scc表达明显低于R1(p＜0.05)。可见StAR表达趋势和睾酮变化较一致。
　　 3、年龄依赖的氧化损伤和抗氧化酶活性变化:蛋白羰基水平在种属和年龄间有交互作用，而MDA的表达在种属和年龄间没有交互作用。抗氧化酶SOD、GPX和CAT活性在种属和年龄间均有交互作用。P8鼠蛋白羰基水平和MDA分别在4、8月龄开始逐渐升高(p＜0.05）。作为抵抗氧化损伤的抗氧化酶SOD和CAT活性8月龄开始下降，而GPX活性在早期阶段4月龄就开始下降(p＜0.05），以上结果表明抗氧化酶SOD、CAT、GPX的活性过早下降可能与P8鼠的较早进入氧化应急状态有关，表现为睾酮合成缺陷。较R1鼠相比，4、8、10月龄的P8鼠SOD、CAT、GPX活性明显降低，以上结果提示:P8鼠的较早出现的以上各种生化指标的改变可能与其加速老化有关。
　　 4、转录因子Nrf2的年龄性变化:Nrf2的表达在种属和年龄间有交互作用。在对照鼠R1睾丸组织核蛋白提取物中Nrf2表达逐渐升高，提示随着年龄性氧化应激的升高，有较多的Nrf2激活进入胞核。在P8鼠睾丸组织核蛋白提取物中，4月龄较2月龄Nrf2水平升高(p＜0.05），而8月龄又明显下降(p＜0.05），且低于2月龄(p＜0.05）。较R1鼠相比，8月龄P8鼠Nrf2水平明显下降(p＜0.05）。免疫荧光结果也显示，8月龄P8鼠Nrf2光密度明显低于相应月龄的R1鼠，此结果与核蛋白Nrf2表达变化一致。
　　 5、促炎症因子的年龄性变化:IL-1β和TNF-α水平在年龄和种属间没有交互作用。8、10月龄的P8和R1鼠，均有IL-1β和TNF-α水平升高(P＜0.001)。较R1鼠相比，P8鼠4、8、10月龄IL-1β和TNF-α水平均升高(P＜0.001)。提示:促炎症因子表现年龄性升高，老化细胞处于一种慢性炎症状态。
　　 6、COX2的表达年龄性变化:种属和年龄之间没有交互作用，P8和R1鼠，COX2的表达均呈现年龄性增高。8、10月龄的P8鼠COX2的表达明显高于2、4月龄(p＜0.05）。较R1鼠相比，8月龄P8鼠COX2的表达明显升高(p＜0.05）。免疫组化结果显示:在P8鼠中，COX2阳性产物主要见于睾丸间质的细胞，阳性细胞密度表现为年龄性增加。与上述结果一致，较R1鼠相比，8月龄P8鼠COX2阳性密度增加。
　　 7、转录因子NF-κB的年龄性变化:种属和年龄之间没有交互作用。P8鼠中，核蛋白提取物中NF-κB表达逐渐升高，8、10月龄NF-κB水平较2、4月龄明显升高(p＜0.05），提示随着年龄的升高，有较多的NF-κB激活进入胞核。R1鼠中，NF-κB表达没有年龄差异。较R1鼠相比，8、10月龄P8鼠NF-κB水平明显高于相应月龄的R1鼠(p＜0.05）。通过免疫荧光方法检测NF-κB蛋白表达情况，结果显示:随着年龄增加，NF-κB荧光密度增加。8月龄P8鼠NF-κB荧光密度强于相应月龄R1鼠，此结果与核蛋白NF-κB表达变化一致。
　　 8、p38MAPK的年龄性变化:种属和年龄的交互作用不明显。P8鼠P-P38(P38MAPKphosphorylation，P-P38)表达随着年龄增加逐渐增加，R1鼠没有明显变化。P8鼠8、10月龄P-P38表达明显高于相应月龄R1鼠。提示:p38MAPK信号途径的激活可能与年龄性小鼠睾酮下降有关。
　　 结论:
　　 在排除其他危险因素的情况下，睾丸老化可能与氧化应激和炎症关系最大。胞核内Nrf2的水平下降，抗氧化酶的低表达导致了细胞对氧化应急的易损性，这可能与其快速老化有关。
　　 此外，年龄相关的ROS所致NF-κB激活似乎与老化过程中睾酮下降关系更密切。我们需要进一步澄清ROS→p38MAPK→NF-κB→COX2的线性关系。总之，在睾丸老化过程中，氧化应激和氧化还原敏感的炎症机制还有待进一步研究。
　　 第二部分，ROS→p38MAPK→COX2、NF-κB→COX2和Nrf2信号通路的年龄性改变对衰老SAMP8小鼠睾丸间质细胞睾酮合成下降的影响
　　 目的:
　　 研究衰老小鼠间质细胞内，ROS→p38MAPK→COX2，NF-κB→COX2以及Nrf2信号通路对睾酮下降的影响。
　　 方法:
　　 1、小鼠睾丸Leydig细胞原代培养及睾酮测量:利用差速贴壁方法分离纯化Leydig细胞，0.4％台盼蓝溶液检测细胞活力，3β-羟基类固醇脱氢酶化学染色和免疫细胞化学染色鉴定细胞纯度。Leydig细胞在黄体生成素刺激2小时(LH，100ng/ml)或基础状态下，取培养基上清用RIA法测睾酮。
　　 2、分别或同时给予p38MAPK抑制剂SB203580和NF-κB抑制剂Bay处理细胞。
　　 3、ROS检测:利用流式细胞仪测量DCFH-DA荧光方法检测ROS。
　　 4、MTT检测:利用3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-联苯四唑氮法检测细胞活力。
　　 5、pEGFP-N1-Nrf2质粒构建、转染、鉴定:小鼠的Nrf2cDNA(1.8kb)片段是通过Sac(I)/Kpn(I)两种内切酶酶切pcDNA3/mNrf2质粒得到，然后插入到带有绿色荧光p-EGFP-N1质粒中，得到pEGFP-N1-Nrf2质粒。
　　 6、免疫双标检测COX2、Nrf2和NF-κB的表达变化。
　　 7、半定量和实时定量PCR技术用来检测COX2和StARmRNA水平变化。
　　 8、Westernblotting用来检测StAR、Nrf2、NF-κB、COX2、P-P38和P38蛋白水平的表达变化。
　　 结果:
　　 1、分离的Leydig细胞纯度达95％以上，可以满足实验需要。
　　 2、分离培养衰老Leydig细胞睾酮分泌的变化:
　　 虽然给予衰老Leydig细胞最大量的黄体生成素刺激后睾酮量明显高于基础水平，但较年轻Leydig细胞睾酮量仍低约70％。
　　 3、衰老Leydig细胞ROS产生的变化:衰老Leydig细胞ROS的产生量明显高于年轻Leydig细胞(p＜0.05）。
　　 4、p38MAPK和/或NF-κB抑制剂对衰老SAMP8小鼠间质细胞睾酮产生、StAR、COX2和Nrf2的影响:用p38MAPK抑制剂SB203580(10μM)处理衰老Leydig细胞，睾酮水平能恢复到年轻细胞约40％水平(p＜0.05)。同样应用NF-κB抑制剂Bay也能部分恢复衰老细胞的睾酮水平(p＜0.05)。同时应用两种抑制剂对睾酮产生能够产生叠加和协同效果(p＜0.05)，提示两种抑制剂分别发挥了各自的作用。
　　 应用免疫双标方法检测到衰老间质细胞经Bay处理后可使COX2蛋白表达明显下降。应用Bay和/或SB203580这两种抑制剂时发现:COX2蛋白和mRNA水平下降(p＜0.05），而StAR蛋白和mRNA水平升高(p＜0.05），同时应用两种抑制剂时有叠加效果(p＜0.05）。可见p38MAPK-COX2和NF-κB-COX2两条通路在年龄性睾酮下降中分别扮演着自己的角色。而且，用Bay处理细胞后意外发现胞核内Nrf2表达增加。
　　 5、瞬时转染Nrf2后对衰老SAMP8小鼠间质细胞的睾酮产生、StAR和COX2的表达影响:转染pEGFP-N1-Nrf2的衰老细胞较对照相比，睾酮产生明显增加，COX2蛋白和mRNA水平明显下降(p＜0.05），而StARmRNA和蛋白水平明显增加(p＜0.05）。
　　 结论:
　　 1、COX2介导的对睾酮产生的抑制作用是选择性依赖于p38MAPK激活的。
　　 2、COX2介导对睾酮产生的抑制作用也可由NF-κB信号途径介导。
　　 3、Nrf2在改善年龄性类固醇合成下降中发挥积极作用。
　　 第三部分，生命不同阶段的适度运动对SAMP8鼠睾丸组织年龄性功能下降的影响
　　 目的:
　　 不同阶段的适度运动对年龄性功能下降，包括:血睾酮水平、炎症和氧化应激相关生化指标的影响。同时检测了调节细胞抗氧化系统的转录因子Nrf2以及调节炎症分子的NF-κB的表达和活性。
　　 方法:
　　 1、本研究中以2月龄平均体重在25g的SAMP8雄性小鼠作为实验对象。每天进行15分钟适度游泳锻练。2-7月龄期间每天进行游泳锻练的作为终身锻练组;2-4月龄期间，生命早期阶段每天进行游泳锻练的作为早期锻练组;5-7月龄期间，生命晚期阶段每天进行游泳锻练作为晚期锻练组。2-7月龄期间不进行游泳锻练的作为静止对照组。待终身锻练组进行完所有锻练后，以上四组同时取材。
　　 2、睾酮测定:RIA法测定血清睾酮水平，批内和批间差异系数分别为8.9％和13.6％。
　　 3、免疫组化和免疫组织荧光方法检测睾丸组织COX2、Nrf2、NF-κB的表达变化。
　　 4、生化学检测MDA和蛋白羰基的氧化程度以及抗氧化酶SOD，CAT和GPX活性变化。
　　 5、Luminex多重细胞因子轮廓分析技术检测促炎症因子TNF-α、IL-1β和抗氧化因子TGF-α、IL-10的水平。
　　 6、RT-PCR检测SOD1、SOD2、GPX、CATmRNA水平的表达变化。
　　 7、Westernblotting检测StAR、Nrf2、NF-κB、COX2蛋白水平的表达变化。
　　 8、EMSA方法检测Nrf2和NF-κB活性的变化。
　　 结果:
　　 1、不同阶段的运动锻炼对睾酮以及睾酮合成酶的影响:较静止组相比，血清睾酮和睾丸内睾酮水平在锻炼组明显增加(P＜0.05），而且终身锻练组和早期锻练组较晚期锻练组和静止组效果更好（P＜0.05）。StAR和P450scc的表达也是如此。
　　 2、不同阶段的锻炼对氧化应激和抗氧化酶的影响:MDA作为脂类过氧化的标记物，锻练组明显降低，而且终身锻练组和早期锻练组较晚期和静止组降低更明显(P＜0.05)。作为蛋白质氧化的生物标记产物蛋白羰基，终身锻练组和早期锻练组较晚期和静止组相比，明显降低(P＜0.05）。而且终身锻练和早期锻练组以及晚期锻练和静止组两两之间没有明显区别。
　　 锻炼组抗氧化酶SOD活性明显高于静止组(P＜0.05)。较晚期和静止组相比，终身锻练组和早期锻练组SOD1和SOD2mRNA水平明显增高（P＜0.05）。GPX活性也表现为终身锻练组和早期锻练组增高明显，GPXmRNA水平在锻练组明显增高(P＜0.05)。
　　 3、不同阶段锻炼对Nrf2活性的影响:免疫荧光结果显示，Nrf2主要在间质细胞和精原细胞表达。蛋白结果均显示锻炼组睾丸组织胞核内Nrf2的表达较静止组相比明显增加，而且终身锻练和早期锻练组明显高于晚期锻练组（P＜0.05）。EMSA结果又进一步验证了终身和早期锻练组胞核提取物有较高的与ARE反应原件结合的活性（P＜0.05）。
　　 4、生命不同阶段锻炼对睾丸巨噬细胞、炎症因子和抗炎症因子的影响:CD68作为巨噬细胞的标记物，通过CD68免疫组化染色进行巨噬细胞的定量测定。较静止组相比，锻炼组CD68阳性巨噬细胞光密度明显降低，而且前两组效果更明显（P＜0.05）。促炎症因子IL-1β和巨噬细胞趋势相同。TNF-α表现为终身锻练组最低，其次是早期锻练组。抗炎症因子TGF-α和IL-10正好相反，表现为:终身锻练和早期锻练明显增加，TGF-α终身锻练组明显高于早期锻练组（P＜0.05）。
　　 5、不同阶段锻炼对COX2表达的影响:与静止组相比，锻炼组COX2表达明显下降，而且锻炼组之间有着明显区别(P＜0.05），终身锻炼和早期锻炼更能明显降低COX2的表达（P＜0.05）。
　　 6、不同阶段锻炼对NF-κB活性的影响:免疫荧光显示NF-κB主要表达于睾丸组织的间质细胞。锻炼组NF-κB蛋白表达明显低于静止组，而且是终身锻炼组最低，其次是早期锻炼组(P＜0.05）。EMSA结果和上述结果一致，表现为终身锻炼和早期锻炼组明显降低了NF-κB与胞核内相应的DNA片段结合的能力(P＜0.05）。
　　 结论:
　　 不同生命阶段的适度锻炼对年龄相关的睾丸生理功能的影响不同。终身和早期锻炼在升高细胞对氧化应激以及炎症的抵抗能力来逆转年龄相关的类固醇类合成酶、睾酮合成下降中更加有益。提示:终身和睾酮下降之前的生命早期阶段的锻炼能较早激活细胞内的抗氧化系统以保护睾丸组织的功能，核转录因子Nrf2和NF-κB作为一对平衡体，在降低炎症和氧化应激中发挥关键作用。

目录

声明

摘要

ABSTRACT

英文缩写

PREFACE

Part Ⅰ Oxidative damage and inflammatory response increase with aging in the mouse testis：the role of transcriptional factor Nrf2 and NF-κ b signaling pathway

INTRODUCTION

MATERIALS AND METHODS

RESULTS

FIGURE

DISCUSSION

Conclusion

REFERENCE

Part Ⅱ Evidence that age-related changes in ROS→p38 MAPK→COX2，NF-κ b→COX2 and Nrf2 signaling pathways contribute to the decreased testosterone production by the Leydig cells from old SAMP8 mice

INTRODUCTION

MATERIALS AND METHODS

RESULT

FIGURE

DISCUSSION

Conclusion

REFERENCE

Part Ⅲ Effects of Moderate Exercise over Different Phases of life on Age-related Physiological Dysfunction in Testes of SAMP8 Mice

INTRODUCTION

MATERIAL AND METHODS

RESULTS

FIGURE

DISCUSSION

Conclusion

REFERENCE

Conclusion

Supplement 1

Review Leydig cell aging and the mechanisms of reduced testosterone production

致谢

个人简历