活血化瘀通络中药防治早期糖尿病肾病的实验研究

摘要

目的:糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)是糖尿病(diabetesmellitus，DM)最常见的慢性并发症之一，也是糖尿病致死的重要原因。糖尿病肾病现已成为发达国家慢性肾衰竭的第一位原发病;在我国，随着糖尿病发病率的快速增加，由DN导致的终末期肾功能衰竭也逐年上升，预计在未来的20年中DN将成为终末期肾衰竭最重要的原因。但到目前为止尚无有效的方法能阻止DN的发生和发展，故防治DN的发生发展已经成为当前急需解决的问题，且DN严重影响患者的生存质量及预后，增加患者的痛苦，因此探讨DN的发病机制，寻求防治DN的有效方法具有重要的意义。
　　 DN主要的病理表现是肾小球毛细血管基底膜弥漫增厚，系膜基质增生，进而造成结节性肾小球硬化。临床表现则以蛋白尿为主，早期的表现为微量白蛋白尿，临床期的表现为大量蛋白尿。DN发生发展的病理机制非常复杂，包括了蛋白的非酶糖基化、氧化应激以及足细胞损伤等等，是多种因素、多条通路协同作用的结果，因而针对DN的治疗也必须是多因素、多靶点的。目前，现代医学防治DN的措施主要有以下几方面:严格控制血糖、血压，纠正血脂紊乱，血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensionconvertingenzymeinhibitors，ACEI)或血管紧张素受体拮抗剂(angiotensinreceptorblockers，ARBs)的应用等，尚无控制DN的特异性药物，且西药副作用较多，在控制临床症状方面难使患者满意。而中医药以其独特的整体调节与辨证论治体系，通过三因制宜的个性化治疗方案，可能对DN发生发展的多个环节起到干预作用，在临床防治DN中显示出巨大的潜力和广阔的应用前景。
　　 课题组结合多年临床治疗DN的经验和中医学病因病机理论，尤其是络病理论，认为DN主要的病机是瘀血阻于肾络，治疗当活血化瘀通络，采用丹参、川芎、地龙、水蛭、全蝎等中药配伍组成活血化瘀通络方，临床观察和前期实验表明该方对DN有较好疗效。本研究采用一次性大剂量链脲佐菌素(Streptozocin，STZ)腹腔注射复制DN大鼠模型，以活血化瘀通络中药进行干预，进行整体研究，观察其对DN模型大鼠肾脏的保护作用;并且采用小鼠条件永生系足细胞进行细胞实验，观察活血化瘀通络中药含药血清及药物单体丹参酮ⅡA对足细胞增殖的影响，进一步验证该复方中药的疗效，探讨其对DN的作用机制，并以效测证，为临床应用提供参考。
　　 方法:
　　 1.活血化瘀通络中药对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用
　　 选取健康、雄性、4～5周龄，体重120g～150g，SD大鼠48只，适应性饲养1周后，检测血糖和尿蛋白，均为阴性者用于实验。随机分为正常组(normalgroup，NG)和造模组。造模组大鼠一次性腹腔注射STZ60mg·kg-1，NG注射相应体积的枸橼酸缓冲液。72h后检测造模组大鼠的空腹血糖(fastingbloodglucose，FBG)，三次连续随机尾静脉血糖≥16.7mmol·L1为DM模型成功。成模大鼠随机分为模型组(modelgroup，MG)、厄贝沙坦组(Irbesartangroup，XG)及活血化瘀通络中药组(huoxuehuayutongluoChinesemedicinegroup，ZG)。ZG给予活血化瘀通络中药免煎颗粒进行灌胃，给药量按照体型系数换算给药剂量的基本公式进行换算。分别按川芎0.96g·kg-1·d-1、丹参1.2g·kg-1·d-1、地龙0.8g·kg-1·d-1、水蛭0.48g·kg-1·d-1、全蝎0.48g·kg-1·d-1进行灌胃。厄贝沙坦组大鼠给予厄贝沙坦15mg·kg-1·d-1灌胃。每日给药一次，连续16周。于给药后的第四周末(4W)、第八周末(8W)、第十二周末(12W)、第十六周末(16W)，代谢笼收集24小时尿液，并测量大鼠的饮水量(waterintake)、进食量(foodintake)、尿量(urineoutput)等。
　　 给药16周末杀检动物，大鼠称体重(bodyweight，BW)，尾静脉取血检测FBG和糖化血红蛋白(HbA1c)。之后，水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血，分离血清，检测肝功能(总蛋白TP、白蛋白ALB)、肾功能(血肌酐SCr、尿素氮BUN)、血脂(总胆固醇TC、甘油三酯TG、高密度脂蛋白胆固醇HDL、极低密度脂蛋白胆固醇VLDL)。留取双肾，称重，计算肾脏指数(kidneyindex，KI)。分离皮质，FAA固定液固定，行光镜检查;4％戊二醛固定，行透射电镜检查，从透射电镜图片上测量肾小球基底膜(glomerularbasementmembrane,GBM)厚度。
　　 2.活血化瘀通络中药对糖尿病肾病大鼠尿微量白蛋白及足细胞裂孔膜蛋白p-cadherin的影响
　　 2.1活血化瘀通络中药对糖尿病肾病大鼠尿微量白蛋白的影响
　　 于给药后的第四周末(4W)、第八周末(8W)、第十二周末(12W)、第十六周末(16w)，代谢笼收集24小时尿液，记录24h尿量，尿液经3000转/分，离心10分钟，取上清，-20℃保存。采用Beckmancx7全自动生化分析仪检测尿微量白蛋白(urinarymicroalbumin，U-Alb)含量。
　　 2.2活血化瘀通络中药对糖尿病肾病大鼠p-cadherin的影响
　　 取材时，快速留取肾皮质，-80℃保存。提取肾组织总RNA，采用反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)和实时定量聚合酶链式反应(Real-TimePCR)检测肾组织p-cadherinmRNA的表达。采用免疫组织化学法(Immunohistochemistry，IHC)检测肾组织p-cadherin蛋白的表达。
　　 3.活血化瘀通络中药对糖尿病肾病大鼠24小时尿蛋白及肾脏纤维化相关因子的影响
　　 3.1活血化瘀通络中药对糖尿病肾病大鼠24小时尿蛋白的影响
　　 于给药后的第四周末(4W)、第八周末(8W)、第十二周末(12W)、第十六周末(16W)，代谢笼收集24小时尿液，记录24h尿量，尿液经3000转/分，离心10分钟，取上清，-20℃保存。采用Beckmancx7全自动生化分析仪测定24小时尿蛋白量(24hUpro)。
　　 3.2活血化瘀通络中药对糖尿病肾病大鼠肾脏纤维化相关因子的影响
　　 取材时，快速留取肾皮质，-80℃保存。检测与肾脏纤维化相关的细胞因子的表达。采用蛋白印迹法(Westernblot)、IHC法及Real-TimePCR法检测肾组织BMP-7及TGF-β1蛋白和mRNA的表达;采用Real-TimePCR法检测肾组织OPNmRNA的表达;采用Westernblot法检测肾组织Smad7蛋白的表达;并分析BMP-7及TGF-β1之间的相关性。
　　 4.活血化瘀通络中药含药血清及药物单体——丹参酮ⅡA对小鼠条件永生系足细胞增殖的影响
　　 体外细胞培养技术培养小鼠条件永生系足细胞，给予大鼠的活血化瘀通络中药含药血清及各浓度的药物单体——丹参酮ⅡA干预后，以MTT法检测足细胞增殖情况。
　　 5.统计学方法
　　 所有资料以(x)±s表示，各组间不同观察点空腹血糖、体重、饮水量、进食量、尿量、24小时尿蛋白和尿微量白蛋白采用重复测量设计资料的单变量方差分析进行比较，各观察点进行组间两两比较;其他数据多组间比较采用One-WayANOVA进行分析，进一步组间两两比较采用SNK法进行;对于不符合正态分布的资料先进行秩和检验，再对秩次进行One-WayANOVA;变量间的相关性采用Person直线相关分析。所有数据分析应用SASV8软件进行，以P＜0.05为差异有显著性。
　　 结果:
　　 1.活血化瘀通络中药对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用
　　 1.1各组大鼠不同观察点空腹血糖(FBG)的比较
　　 与NG比较，MG、ZG和XG大鼠FBG明显升高(P＜0.05）;而与MG比较，ZG和XG大鼠FBG无统计学差异(P＞0.05）;且在4个月内MG、ZG和XG大鼠FBG水平一直稳定，没有明显变化(P＞0.05)。
　　 1.2各组大鼠不同观察点体重(BW)的比较
　　 NG大鼠体重逐渐增加;与NG比较，MG、ZG、XG大鼠BW明显减轻(P＜0.05），且MG大鼠BW呈现逐渐下降趋势。而与MG比较，ZG和XG大鼠BW下降有所减轻，且ZG和XG大鼠从8W开始体重明显高于MG，差异有显著性(P＜0.05）;治疗组间比较，在各观察点大鼠体重无统计学差异(P＞0.05）。
　　 1.3各组大鼠不同观察点饮水量(waterintake)的比较
　　 与NG比较，MG、XG和ZG大鼠waterintake显著增加(P＜0.05）;且MG大鼠waterintake随时间呈逐渐增加趋势。与MG比较，ZG大鼠waterintake从12W开始显著减少(P＜0.05);XG大鼠waterintake无显著性差异（P＞0.05）。
　　 1.4各组大鼠不同观察点进食量(foodintake)的比较
　　 与NG比较，MG、ZG和XG大鼠foodintake显著增加(P＜0.05);与MG比较，ZG和XG大鼠foodintake增加有所改善，但显效缓慢，从12W开始foodintake增加显著改善(P＜0.05)。治疗组间比较，在各观察点foodintake无统计学差异(P＞0.05）。
　　 1.5各组大鼠不同观察点尿量(urineoutput)的比较
　　 与NG比较，MG、ZG和XG大鼠urineoutput显著增加(P＜0.05);MGurineoutput呈逐步增加趋势。与MG比较，ZG大鼠urineoutput增加趋势趋缓，且在16W时显示出明显改善(P＜0.05);XGurineoutput呈逐步增加趋势，且于8W时高于MG。两治疗组间比较，第8W时ZGurineoutput显著少于XG，有统计学差异(P＜0.05）。
　　 1.6各组大鼠HbA1c、KI、BUN、SCr、TP和ALB的比较
　　 与NG相比，MG、ZG和XG大鼠HbA1c、KI显著升高（P＜0.05）;与、MG相比，ZG和XG大鼠HbA1c、KI无统计学差异（P＞0.05）。与NG比较，MG、ZG和XG大鼠BUN均显著升高（P＜0.05），而与MG比较，ZG和XG大鼠BUN显著降低（P＜0.05），两治疗组间比较，无统计学差异（P＞0.05）。与NG比较，MG、ZG和XG大鼠SCr均显著降低（P＜0.05），而与MG比较，ZG和XG大鼠SCr显著升高（P＜0.05），两治疗组间比较，XG大鼠SCr显著升高（P＜0.05）。与NG相比，MG大鼠TP和ALB显著降低（P＜0.05）;与MG相比，ZG和XG大鼠TP和ALB显著升高（P＜0.05）;两治疗组间比较，无统计学差异（P＞0.05）。
　　 1.7各组大鼠血脂(TC、TG、HDL、VLDL)的比较
　　 TC和HDL:各组大鼠之间无显著性差异（P＞0.05）。与NG比较，MG大鼠TG显著升高（P＜0.05），而与MG比较，ZG和XG大鼠TG显著降低（P＜0.05），两治疗组间比较，无统计学差异（P＞0.05）。与NG比较，MG大鼠VLDL显著升高（P＜0.05），而与MG比较，ZG和XG大鼠VLDL显著降低（P＜0.05），两治疗组间比较，无统计学差异（P＞0.05）。
　　 1.8各组大鼠肾组织病理形态学改变的比较
　　 光镜观察:NG大鼠肾脏肾小球结构清晰完整，未见明显肥大及萎缩，基底膜无增厚，系膜无增生。MG大鼠可见肾小球明显肥大，肾小囊腔呈裂隙状，肾小球基底膜明显增厚，系膜基质增多，系膜区增宽，部分肾小管上皮细胞空泡样变;与MG比较，ZG和XG大鼠肾脏病变有一定程度的改善，两治疗组间差异不明显。
　　 电镜观察:NG大鼠肾组织结构正常，肾小球毛细血管基底膜(GBM)结构清晰，均匀无增厚，上皮足突分布均匀，足突排列整齐、系膜细胞无增殖、系膜基质无增生。MG可见GBM结构欠清晰、均匀弥漫增厚，足细胞足突增宽或大片融合，内皮细胞高度融合，窗口大部分消失。与MG比较，ZG和XG病理改变均有所减轻，GBM结构较清晰，足突节段融合。两治疗组间差异不明显。
　　 1.9各组大鼠GBM厚度的比较
　　 与NG比较，MG、ZG和XG大鼠GBM明显增厚（P＜0.05）;与MG比较，ZG和XG大鼠GBM明显减薄（P＜0.05）;与XG比较，ZG大鼠GBM明显减薄（P＜0.05）。
　　 2.活血化瘀通络中药对糖尿病肾病大鼠尿微量白蛋白及足细胞裂孔膜蛋白p-cadherin的影响
　　 2.1各组大鼠不同观察点尿微量白蛋白(U-Alb)的比较
　　 与NG比较，MG、ZG和XG大鼠U-Alb显著增加(P＜0.05）。与MG比较，ZG和XG大鼠U-Alb增加趋势趋缓;且从8W至16W各时间点均显示出明显改善（P＜0.05）。两治疗组间比较，在各观察点U-Alb无统计学差异（P＞0.05）。
　　 2.2各组大鼠肾组织中p-cadherinmRNA表达的比较
　　 与NG比较，MGp-cadherinmRNA表达水平明显降低(P＜0.05）;与MG比较，ZG和XGp-cadherinmRNA表达水平均明显升高（P＜0.05），两治疗组之间无统计学差异(P＞0.05）。
　　 2.3各组大鼠肾组织中p-cadherin蛋白表达的比较
　　 IHC染色显示:NGp-cadherin蛋白表达较强，主要呈线性分布于肾小球基底膜处，棕黄色颗粒呈深染。与NG比较，MG棕黄色颗粒明显减少。与MG比较，ZG和XG棕黄色颗粒不同程度地增多。
　　 3.活血化瘀通络中药对糖尿病肾病大鼠24小时尿蛋白及肾脏纤维化相关因子的影响
　　 3.1各组大鼠不同观察点24hUpro的比较
　　 与NG比较，MG、ZG和XG大鼠24hUpro显著增加(P＜0.05）。与MG比较，ZG和XG大鼠24hUpro增加趋势趋缓，且在12W、16W时显示出明显改善(P＜0.05)。两治疗组间比较，在各观察点24hUpro无统计学差异（P＞0.05）。
　　 3.2各组大鼠肾组织中BMP-7蛋白及mRNA表达的比较
　　 IHC染色显示:在正常及DN大鼠肾脏均有BMP-7蛋白表达，而在NG组呈强阳性表达，主要位于肾小管和集合管，呈胞浆表达阳性，胞浆呈棕黄色颗粒状。IHC、Western-blot及Real-TimePCR法检测结果均显示:与NG大鼠比较，MG、ZG和XGBMP-7蛋白和mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）;与MG比较，ZG和XGBMP-7蛋白和mRNA表达水平均明显增加（P＜0.05），两治疗组之间无统计学差异（P＞0.05）。
　　 3.3各组大鼠肾组织中TGF-β1蛋白及mRNA的表达
　　 IHC染色显示大鼠肾脏TGF-β1蛋白在肾小球及肾小管间质均有表达。NG大鼠肾脏TGF-β1表达量很少，着色浅。MG大鼠肾脏TGF-β1蛋白表达明显增加，呈强阳性表达，着色深。ZG和XG大鼠肾脏TGF-β1蛋白呈弱阳性表达，介于NG和MG之间。Western-blot及Real-TimePCR法检测结果显示:与NG比较，模型组TGF-β1蛋白和mRNA表达水平明显升高(P＜0.05）;与MG比较，TGF-β1蛋白和mRNA表达水平均明显降低（P＜0.05），两治疗组之间无统计学差异(P＞0.05）。
　　 3.4各组大鼠肾组织中Smad7蛋白的表达
　　 Western-blot结果显示:与NG比较，MG、ZG和XGSmad7蛋白的表达水平明显降低(P＜0.05）;与MG比较，ZG和XGSmad7蛋白的表达水平明显升高(P＜0.05），两治疗组之间无统计学差异(P＞0.05）。
　　 3.5各组大鼠肾组织OPNmRNA的表达
　　 与NG比较，MG、ZG和XGOPNmRNA表达明显增加（P＜0.05）;与MG比较，ZG和XGOPNmRNA表达均明显减少（P＜0.05），两治疗组之间无统计学差异（P＞0.05）。
　　 3.6MGBMP-7和TGF-β1表达的相关性分析
　　 分析结果显示:肾组织BMP-7和TGF-β1表达的关系:两者在核酸和蛋白表达的相关系数r分别为-0.9269和-0.9055，说明两者的表达呈负相关(P＜0.05）。
　　 4.活血化瘀通络中药含药血清及药物单体——丹参酮ⅡA对小鼠条件永生系足细胞增殖的影响
　　 4.1活血化瘀通络中药含药血清对足细胞增殖的影响
　　 与低糖对照组相比，活血化瘀通络中药含药血清组在任何时间段均没有统计学差异(P＞0.05）;高糖对照组在36h出现了增殖抑制作用，有统计学差异(P＜0.05）;与高糖对照组相比，活血化瘀通络中药含药血清组只在48h出现了明显的促进增殖作用（P＜0.05）。
　　 4.2丹参酮ⅡA对足细胞增殖的影响
　　 与低糖对照组相比，足细胞在含有不同浓度(1×10-8mol/L～1×10-4mol/L)TanshinoneⅡA的培养基中:培养12h后，各浓度未出现明显的促增殖作用（P＞0.05）;培养24h后，1×10-7mol/L、1×10-8mol/L浓度出现了明显的促进增殖的作用（P＜0.05）;培养36h后，1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L浓度出现了明显的促进增殖的作用（P＜0.05）;培养48h后，各浓度均有明显的促进增殖作用（P＜0.05）。
　　 与高糖对照组相比，足细胞在含有不同浓度(1×10-8mol/L～1×10-4mol/L)TanshinoneⅡA的培养基中:培养12h后，各浓度未出现明显的促增殖作用(P＞0.05）;培养24h后，1×10-7mol/L、1×10-8mol/L浓度出现了明显的促进增殖的作用（P＜0.05）;培养36h后，1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L各浓度均出现了明显的促进增殖的作用(P＜0.05）;培养48h后，各浓度均有明显的促进增殖作用(P＜0.05）。
　　 结论:
　　 1.一次性大剂量STZ腹腔注射可成功复制DN大鼠模型。
　　 2.活血化瘀通络中药能显著改善DN大鼠一般状况，“三多一少”表现及脂代谢紊乱，减少尿蛋白排泄，保护肾功能，减轻肾脏病理损害及肾小球肥大和肾小球基底膜增厚，具有肾保护作用。
　　 3.活血化瘀通络中药能明显上调p-cadherin蛋白和mRNA的表达，从而减少蛋白尿的产生，进而保护肾功能，延缓肾小球硬化的发生和发展。
　　 4.活血化瘀通络中药能明显减少DN大鼠24小时尿蛋白的产生，并能上调BMP-7和Smad7的表达、明显下调TGF-β1和OPN的表达，从而减少细胞外基质堆积，进而延缓肾脏纤维化和肾小球硬化的发展。
　　 5.活血化瘀通络中药含药血清对足细胞具有促进增殖作用;丹参酮ⅡA各浓度对于足细胞具有明显的促进增殖的作用，从而增强足细胞的自我修复能力，进而减少蛋白尿的产生，保护肾功能。这一结果与本实验中整体研究结果一致，从而从细胞生物学上对活血化瘀通络中药治疗DN的可能作用机制予以了进一步的佐证，并对中药单体的应用提供了依据。
　　 6.以效测证，从本研究结果可以反证DN的证候属于瘀血阻络证。
　　 7.活血化瘀通络中药与西药对照药厄贝沙坦的疗效相当。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 活血化瘀通络中药对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 活血化瘀通络中药对糖尿病肾病大鼠尿微量白蛋白及足细胞裂孔膜蛋白p-cadherin的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 活血化瘀通络中药对糖尿病肾病大鼠24小时尿蛋白及肾脏纤维化相关因子的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分 活血化瘀通络中药含药血清及丹参酮ⅡA对高糖培养的小鼠永生系足细胞增殖的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述

致谢

个人简历