益气养阴化瘀通络中药防治早期糖尿病肾病的临床与实验研究

摘要

目的：糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者最主要的微血管并发症之一，也是导致终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)的首位病因。DN的病理表现主要为肾小球肥大，细胞外基质(extracellulaurmatrix，ECM)增生，肾小球系膜区增宽及毛细血管基底膜增厚，最后进展至肾小球硬化。其发病机制涉及遗传、糖代谢紊乱、血流动力学改变、细胞因子、炎症介质等多种因素环节。DN的防治至今尚无有效手段。而中医药对DN的防治存在着巨大潜力。我们根据中医学病机理论，并结合临床实践，逐步认识到消渴日久，缠绵不愈，伤阴耗气，气阴两虚为本病基本病机，久病入络，由气阴两虚而致之痰、瘀、湿交阻络脉，深伏于肾络，渐成微小癥积而发为本病。鉴于此，我们提出“益气养阴化瘀通络法”治疗DN，并依法组方。我们前期的临床及实验研究，均取得了较好的疗效。本研究继续从临床和实验两个角度进行更深入的研究，以氧化应激、JNK信号通路和细胞凋亡相关蛋白Caspase-3作为切入点，与目前欧盟批准用于治疗DN的药物厄贝沙坦从以上方面进行比较，继续进行中药多途径、多靶点治疗DN的探索性实验研究，旨在寻找一条治疗DN的有效方法。
　　方法：
　　1益气养阴化瘀通络中药治疗早期糖尿病肾病的临床研究
　　选择Ⅲ期DN患者78例，将病例随机分为益气养阴化瘀通络中药组(治疗组)39例和厄贝沙坦组(对照组)39例。治疗组予益气养阴化瘀通络中药，每日1付，水煎400ml，分2次口服；对照组予厄贝沙坦150mg/次，1次/d。观察1年。所有患者于用药前和疗程结束后分别检测尿白蛋白排泄率(UAER)及血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、血脂(TC、TG)并观察终点事件发生率，记录患者的症状、体征及积分情况。
　　2益气养阴化瘀通络中药对糖尿病大鼠肾脏的保护作用
　　健康雄性SD大鼠45只，体重为120g～150g，普通饲料适应性喂养一周后，检测血糖和尿蛋白，均为阴性者用于实验。随机分为正常组和造模组，其申正常组大鼠给予普通饲料喂养，造模组给予高脂饲料。高脂饲料喂养十二周后，造模组大鼠一次性腹腔注射STZ30mg·kg-1，72h后测血糖，三次连续随机尾静脉血糖≥16.7mmol·-1为DM模型成功，并继续给予高脂饲料喂养。造模组大鼠随机分为模型组、厄贝沙坦组及中药组。
　　厄贝沙坦组大鼠给予厄贝沙坦11.51mg·kg-1·d-1灌胃，中药组大鼠给予中药配方颗粒1.0g·kg-1·d-1灌胃，余组给予等剂量生理盐水灌胃，每日给药一次，连续32周。于给药第32周末，收集24h尿液，股动脉采血，处死大鼠，分离肾脏皮髓质，检测各组大鼠24h尿蛋白定量，光镜、电镜下观察各组大鼠肾脏的病理改变，并应用RT-PCR检测各组大鼠肾皮质Ⅰ型胶原mRNA表达水平。
　　3益气养阴化瘀通络中药对糖尿病大鼠肾脏ROS介导JNK信号通路的影响
　　动物模型的建立及给药方法同上，于给药第32周末，留取肾组织标本，采用FCM方法检测各组大鼠肾组织ROS水平；采用Western-blot及FCM方法检测各组大鼠肾组织JNK、p-JNK蛋白的表达水平。
　　4益气养阴化瘀通络中药对糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡的影响
　　动物模型的建立及给药方法同上，于给药第32周末，留取肾组织标本，采用FCM方法检测各组大鼠肾脏细胞凋亡率；采用RT-PCR及IHC方法检测检测各组大鼠肾组织Caspase-3 mRNA和蛋白的表达水平；采用Western-blot及FCM方法检测各组大鼠肾组织Caspase-3、Activedcaspase-3蛋白的表达水平。
　　结果：
　　1益气养阴化瘀通络中药治疗早期糖尿病肾病的临床研究
　　1.1两组总体疗效比较
　　治疗组37例，显效18例，有效13例，无效6例，总有效率达83.8％；对照组38例，显效10例，有效13例，无效15例，总有效率达60.5％。两组相比较，治疗组疗效明显高于对照组，差异有统计学意义(χ2=6.131，P＜0.05)。
　　1.2中医证候积分比较
　　两组治疗前比较无统计学差异(P＞0.05)；治疗组治疗前后比较，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)；对照组治疗前后神疲乏力、腰脊酸痛症状改善明显，差异有统计学意义(P＜0.05)，其余症状无明显改善；两组治疗后比较，差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。
　　1.3治疗前后尿白蛋白排泄率、血肌酐、尿素氮、血脂比较
　　两组治疗前比较无统计学差异(P＞0.05)；两组治疗后尿白蛋白排泄率、血肌酐、尿素氮、血脂均较治疗前显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)；两组各项治疗后比较，治疗组血脂较对照组明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，而尿白蛋白排泄率、血肌酐、尿素氮两组之间均无统计学意义(P＞0.05)。
　　1.4终点事件发生率比较
　　治疗组终点事件发生率为5.4％，对照组为10.5％，两者相比较，治疗组要低于对照组，但无统计学意义(P＞0.05)。
　　2益气养阴化瘀通络中药对糖尿病大鼠肾脏的保护作用
　　2.1各组大鼠24h尿蛋白定量(U Pro)的比较
　　与正常组比较，模型组与两治疗组U Pro均有升高(P＜0.01)：与模型组比较，两治疗组U Pro均有下降(P＜0.01)，两治疗组之间无统计学意义(P＞0.05)。
　　2.2各组大鼠肾脏病理形态学观察
　　光镜观察：正常组大鼠肾脏肾小球结构清晰完整，未见明显肥大及萎缩，基底膜无增厚，系膜无增生。模型组大鼠肾脏肾小球明显肥大，肾小囊腔呈裂隙状，基底膜明显增厚，系膜增生，系膜区增宽，部分肾小管上皮细胞细胞排列紊乱、肥大、空泡样变性。与模型组比较，厄贝沙坦及中药组病理改变也有所改善，但两治疗组间差异不明显。
　　电镜观察：正常组大鼠肾组织结构正常，肾小球毛细血管基底膜均匀无增厚，上皮足突分布均匀。模型组肾小球毛细血管基底膜高度匀质样增厚；足细胞足突广泛融合；内皮细胞高度融合，窗口大部分消失。与模型组比较，两治疗组病理改变也有所改善，但两治疗组间差异不明显。
　　2.3肾皮质Col-Ⅰ mRNA表达比较
　　与正常组比较，模型组及两治疗组Col-Ⅰ mRNA表达均明显增加(P＜0.01)。与模型组比较，两治疗组Col-Ⅰ mRNA表达均明显减少(P＜0.05，P＜0.01)，两治疗组之间无统计学意义(P＞0.05)。
　　3益气养阴化瘀通络中药对糖尿病大鼠肾脏ROS介导JNK信号通路的影响
　　3.1流式细胞术方法检测肾组织中ROS水平
　　与正常组比较，模型组及两治疗组ROS水平均增加(P＜0.01)。与模型组比较，两治疗组ROS水平均减少(P＜0.01)，两治疗组之间无统计学意义(P＞0.05)。
　　3.2 Western-blot及流式细胞术方法检测肾组织中JNK、p-JNK蛋白的表达
　　与正常组比较，模型组及两治疗组JNK、p-JNK.蛋白表达量均增加(P＜0.01)。与模型组比较，两治疗组JNK、p-JNK蛋白表达量均减少(P＜0.05，P＜0.01)，两治疗组之间无统计学意义(P＞0.05)。
　　4益气养阴化瘀通络中药对糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡的影响
　　4.1流式细胞术检测肾组织细胞凋亡率
　　与正常组比较，模型组及两治疗组细胞凋亡率均增加(P＜0.01)。与模型组比较，两治疗组细胞凋亡率均减少(P＜0.01)，两治疗组之间无统计学意义(P＞0.05)。
　　4.2 RT-PCR及免疫组织化学方法检测肾组织中Caspase-3 mRNA和蛋白的
　　表达
　　与正常组比较，模型组及两治疗组Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平均增加(P＜0.01)。与模型组比较，两治疗组Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平均减少(P＜0.01)，两治疗组之间无统计学意义(P＞0.05)。
　　4.3 Western-blot及流式细胞术方法检测肾组织Caspase-3、Activedcaspase-3蛋白的表达
　　与正常组比较，模型组及两治疗组Caspase-3、Actived caspase-3蛋白表达量均增加(P＜0.01)。与模型组比较，两治疗组Caspase-3、Activedcaspase-3蛋白表达量均减少(P＜0.01)，两治疗组之间无统计学意义(P＞0.05)。
　　结论：
　　1.益气养阴化瘀通络中药能明显改善早期DN患者的症状、体征，并且总体疗效和中医证候疗效均优于厄贝沙坦。
　　2.益气养阴化瘀通络中药能明显调节脂代谢紊乱，降低早期DN患者尿白蛋白排泄率、血肌酐、尿素氮，保护肾功能，从而延缓DN的进展。但由于随访时间和样本量的局限，其疗效还有待于长期预后研究的进一步证实。
　　3.益气养阴化瘀通络中药可改善DN大鼠一般状况，减少尿蛋白排泄，减轻肾脏病理损害，并下调Col-Ⅰ表达，从而减少细胞外基质积聚，进而延缓肾小球硬化的发生发展。
　　4.益气养阴化瘀通络中药能减少DN大鼠肾脏细胞凋亡数量，抑制糖尿病大鼠肾脏氧化应激反应，抑制JNK信号通路的活化，从而下调Caspase-3和Actived caspase-3表达，进而干预DN大鼠肾脏细胞凋亡，这可能是其发挥肾脏保护作用的机制之一。