淫羊藿苷促进兔颅骨缺损修复愈合的影响和机制的探讨

摘要

目的:
　　 由于感染，外伤，肿瘤，先后天畸形，内分泌系统疾病造成的骨缺损，畸形，功能障碍，给患者的生活质量带来很大的影响，尤其是对于口腔颌面部。因此寻找一种简便、快捷、有效的方法促进骨创的修复，成为外科领域研究的热点和难点。
　　 目前对如何促进骨愈合的研究很多。一些高分子生物材料植入，人工替代物植入，自体骨移植，组织工程化骨移植，低强度脉冲电磁场治疗等均有一定疗效，由于都存在或多或少的缺点，未能在临床上广泛应用。
　　 多年以来，国内外学者借助组织学、组织化学，组织形态计量学，生物力学等手段对骨创愈合进行了大量的实验观察，对骨创愈合机制也进行了广泛的探讨。近年来，由于基因技术的发展应用，人们对骨创愈合的认识已从细胞生物学向分子生物学水平深化，并随着分子生物学的不断发展，已经认识到骨创愈合与多种生长因子有关，除内分泌、代谢因子等全身因子外，骨创局部尚有大量的生长因子，对骨创愈合起着重要的调节作用，如:TGF-β(转化生长因子)，VEGF(血管内皮细胞生长因子)，FGF(成纤维细胞生长因子)，BMP(骨形态发生蛋白)，神经生长因子(nervegrowthfactor，NGF)等。
　　 中药对加速骨折愈合机理的实验研究始自上世纪60年代，大致有如下几个方面的成果:中药改善骨折部的血液供应，促进血肿的吸收与机化;促进矿物质的沉积;增加成骨细胞的数量和活性，提高微量元素等。淫羊藿(Herbaepimedii)是一种传统的补益中药，临床上用来治疗骨折及与骨代谢有关的许多疾病，并取得了良好的效果。研究结果表明，淫羊藿具有增强机体免疫功能，抗肿瘤，影响内分泌加强性腺功能、延缓衰老和影响心血管系统等多种重要的药理活性。淫羊藿的有效活性成分淫羊藿苷(icariin，C33H40O15，分子量:676.67)，属黄酮类化合物。李芳芳等将淫羊藿苷与大鼠卵泡颗粒细胞和肾上腺皮质细胞共同培养，显示一定浓度的淫羊藿苷可促使卵泡颗粒细胞分泌雌二醇，高浓度时还可促进肾上腺皮质细胞分泌皮质类固醇，提示淫羊藿补肾壮阳功效:作用下丘脑垂体-性腺轴及肾上腺轴，可有效调节体内激素的水平，改善骨代谢，促进蛋白质合成。由于淫羊藿苷在骨创愈合，修复中起到积极的作用，淫羊藿在促进骨愈合方面的研究成为研究热点，淫羊藿提取物:淫羊藿苷对成骨细胞增殖代谢的影响，体外实验董福生课题组已经完成。
　　 本研究通过制作新西兰大白兔颅骨模型，术后采用淫羊藿苷灌胃，应用组织学和骨计量学方法，观察在骨缺损不同的愈合阶段，颅骨缺损区新生骨量，骨愈合速度和成骨质量。
　　 同时提取颅骨缺损修复区新生骨组织mRNA，采用RT-PCR(realtime-polymerasechainreaction)方法，检测成骨细胞促进骨生成的基因变化情况，进一步研究在新骨形成的过程中和应用淫羊藿苷治疗后，相关基因的变化，相互联系，寻找成骨的分子信号传导通路。
　　 在以上研究的基础上，通免疫组化方法，观察新骨形成区骨钙素和骨桥素的表达，初步探讨淫羊藿苷促进骨形成的机制。为淫羊藿苷在促进骨愈合的临床应用提供理论依据，奠定基础。
　　 方法:
　　 1、淫羊藿苷对兔颅骨缺损修复愈合质量的影响
　　 选用2月龄雌性新西兰大白兔，随机分为用药组和对照组，制作颅骨缺损动物模型，用药组术后给予淫羊藿苷灌胃，分别于术后4周、8周、12周处死动物，留取标本，拍射X线片观察;制作组织切片，HE染色，观察颅骨缺损区愈合情况;骨计量学观察新骨形成区骨小梁平均宽度(TraberculaeWidth，Tb·Wiμm)，骨小梁面积比(TrabercularAreaTb.Ar％)，成骨细胞个数(OsteoblastNumber,OB·N)，破骨细胞个数(OsteoclastNumber,OC·N)，观察新骨形成区骨量的变化，研究淫羊藿苷对兔颅骨缺损愈合的影响。
　　 2、淫羊藿苷促进兔颅骨缺损修复RANKL基因、RUNX2基因表达的影响
　　 选用2月龄雌性新西兰大白兔，动物分组，动物模型制作，动物给药方法和剂量同第一部分，分别于术后4周、8周、12周留取标本后，提取颅骨缺损修复区新生骨组织mRNA，采用RT-PCR(realtime-polymerasechainreaction)方法，检测成骨细胞促进骨生成的基因变化情况，本部分实验所研究差异表达基因的重点:是关于成骨细胞增殖分化调节、成骨细胞功能调节和骨代谢调节等方面。
　　 3、淫羊藿苷促进兔颅骨缺损修复区成骨相关蛋白骨钙素、骨桥素的表达
　　 选用2月龄雌性新西兰大白兔，动物分组，动物模型制作，动物给药方法和剂量同第一部分，分别于术后4周、8周、12周留取标本后，通过免疫组化方法，观察新骨形成区成骨细胞骨基质蛋白的表达情况:骨钙蛋白和骨桥蛋白的表达。
　　 结果:
　　 1、淫羊藿苷对兔颅骨缺损修复愈合质量的影响
　　 1.1、一般观察
　　 术后4周，对照组骨缺损区微凹陷，为纤维组织覆盖，边界清晰可辩，周边未见明显新骨形成。实验组颅骨缺损区中央局部凹陷，边界模糊不清，周围可见少量薄、半透明新骨生长。
　　 术后8周，对照组骨缺损区表面及周边部骨痂形成，中央部略凹陷，较边缘为薄。实验组骨缺损区被均匀的硬组织覆盖，与周边骨质有明显骨融合。
　　 术后12周，对照组骨缺损区表面及周边部骨痂形成，形态基本接近正常颅骨外形。实验组骨缺损区可见新形成的骨组织覆盖，与边缘无明显界限。
　　 1.2、X线观察
　　 术后4周，对照组骨缺损处为低密度影，骨缺损边清晰。实验组缺损处为低密度影，骨缺损边缘模糊。
　　 术后8周，对照组骨缺损区域密度低于缺损周围骨质，与正常组织间界限明显。实验组骨缺损区域内密度略高于对照组，界限模糊，缺损范围明显缩小。
　　 术后12周，对照骨组缺损区域呈骨性低密度区，与正常组织间界限明显。实验组缺损区域与周围骨质无明显界限，密度基本一致。
　　 1.3、组织学观察
　　 术后4周，对照组可见缺损边缘有少量类骨质和新骨形成，中央为纤维组织，大量的炎性细胞广泛浸润。实验组缺损区中央为纤维结缔组织充填，可见粗大的胶原纤维，中间散在少量炎性细胞，部分区域出现纤维骨样结构，大量新生骨质，成骨细胞较多成栅栏状排列在骨小梁周围。
　　 术后8周，对照组缺损区存在大量结构疏松的纤维结缔组织，且炎症细胞仍广泛存在，缺损区边界有部分骨样和纤维骨样组织生成，其内有一定量的成骨细胞存在。实验组缺损区内有大量骨质形成，骨小梁连续，增厚，形成板层结构，部分成网织状，为较成熟骨，部分区域内骨质致密，形成板层状骨，中央为骨髓腔。
　　 术后12周，对照组新生骨向中央逐渐充填骨缺损，缺损内可见较多新生的编织骨及板层骨。骨小梁连续，细胞成分较少，纤维成分较实验组多。实验组骨缺损处为成熟骨质，骨细胞丰富，骨小梁粗大，排列整齐，较明显的骨髓腔出现并连续。
　　 1.4、骨计量学观察
　　 术后4周，用药组与对照组比较:用药组的松质区骨量(Tb·Ar％)，骨小梁宽度(Tb·Wiμm)，成骨细胞个数(OB·N)均明显大于对照组(P＜0.01);破骨细胞个数(CB·N)明显低于对照组(P＜0.01)。术后8周，用药组与对照组比较:用药组的松质区骨量（Tb·Ar％），骨小梁宽度(Tb·Wiμm)，成骨细胞个数(OB·N)均明显大于对照。组(P＜0.01);破骨细胞个数(CB·N)明显低于对照组(P＜0.01)。术后12周，用药组与对照组比较:用药组的松质区骨量（Tb·Ar％），骨小梁宽度(Tb·Wiμm)，成骨细胞个数(OB·N)均明显大于对照组(P＜0.01);破骨细胞个数(CB·N)两组之间无显著性差异(P＞0.05)。
　　 2、淫羊藿苷促进兔颅骨缺损修复RANKL基因、RUNX2基因表达的影响
　　 2.1、mRNA纯度及完整性鉴定
　　 分光光度法测定结果显示:对照组及用药组总RNA的OD260/OD280比值在1.8～2.0之间，纯度及浓度符合实验要求。
　　 琼脂糖凝胶电泳结果显示:对照组及用药组总RNA经变性凝胶电泳后可见明显的28S及18S条带出现，28S条带亮度约为18S条带的两倍，各组提取的RNA完整性良好，符合实验要求。
　　 2.2、Real-timePCR定量分析结果
　　 在术后4周，8周，12周时用药组和对照组Rank1、Runx2基因的mRNA表达结果:在术后4周，8周，12周时Rank1基因表达水平用药组均明显低于对照组，Runx2基因的表达水平用药组均明显高于对照组。
　　 3、淫羊藿苷促进兔颅骨缺损修区成骨相关蛋白骨钙素，骨桥素的表达
　　 3.1、骨钙素OC在新骨形成区的表达
　　 用药后4周，实验组骨钙素OC的表达呈强阳性;对照组，OC在成骨细胞的胞浆和骨基质中阴性表达。8周时实验组OC的表达呈强阳性，对照组呈弱阳性表达。12时周实验组OC的表达呈强阳性，对照组呈弱阳性表达。
　　 3.2、骨桥素OPN在新骨形成区的表达
　　 用药后4周实验组骨桥素OPN在成骨细胞的胞浆中呈强阳性表达，在骨基质中呈强阳性表达，对照组呈阴性表达。8周时实验组OPN的表达为强阳性;对照组呈弱阳性表达。12周时实验组OPN在呈强阳性表达;对照组呈弱阳性表达。
　　 结论:
　　 1、淫羊藿苷能够增加兔颅骨缺损区成骨骨量，提高愈合质量。
　　 2、淫羊藿苷能够促进兔颅骨缺损愈合，加快颅骨缺损的愈合速度。
　　 3、淫羊藿苷在成骨过程中，发挥雌激素样作用，通过下调Rank1基因，减少破骨细胞的活化，抑制破骨细胞的功能，增加成骨。
　　 4、淫羊藿苷能上调成骨基因Runx2，通过经典Wnt/β-catenin途径，有效地促进骨愈合。
　　 5、淫羊藿苷促进颅骨缺损区成骨细胞成骨蛋白骨钙素的分泌，增加新骨形成的骨量，促进骨组织的愈合。
　　 6、淫羊藿苷促进颅骨缺损区成骨细胞成骨蛋白骨桥素的分泌，抑制破骨细胞的活性，增加缺损区骨量，加速骨组织愈合。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

课题流程图

第一部分 淫羊藿苷促进兔颅骨缺损修复愈合影响组织学观察

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 淫羊藿苷促进兔颅骨缺损修复RANKL基因、RUNX2基因表达的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分 淫羊藿苷促进兔颅骨缺损修复区成骨相关蛋白骨钙素，骨桥素的表达

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述一

综述二

致谢

个人简历