紫杉醇对破骨细胞形成、分化及凋亡的影响

摘要

目的:利用RAW264.7小鼠巨噬细胞株（破骨前驱细胞株）培养系，研究紫杉醇对体外培养的破骨前驱细胞形成及分化的影响，并通过流式细胞技术，观察紫杉醇是否通过调亡途径抑制破骨前驱细胞的形成及分化。
　　 方法:选用RAW264.7小鼠巨噬细胞株（破骨前驱细胞株），进行破骨细胞的体外诱导培养，观察紫杉醇对破骨细胞形成及分化的影响，并通过流式细胞术分析紫杉醇是否对破骨细胞凋亡途径有影响。
　　 1、细胞培养及药物添加:
　　 1.1、细胞复苏和培养:从-70℃液氮罐中取冻存RAW264.7小鼠巨噬细胞株2管，迅速放入37℃恒温水浴箱中快速复苏（复苏时间小于1分钟），然后放至盛有10％胎牛血清的α-MEM培养液的离心管中离心5分钟(1000转/分)，弃去上清液，再加入含10％胎牛血清的α-MEM培养液10ml，吹打混匀后使形成单细胞悬液，然后移至培养瓶中，放置于37℃、5％CO2培养箱中孵育48-72小时，待培养瓶底细胞密度达到90％以上时，用1％胰酶+EDTA将细胞重悬收集细胞于离心管内离心5分钟（1000转/分），离心后弃去上清液，再加入含10％胎牛血清的α-MEM培养液5ml，充分吹打混匀后使细胞重悬成单细胞悬液，用细胞计数板算出此时的细胞浓度，然后配制成4.5×104cells/ml目的浓度的细胞悬液，加入破骨细胞分化因子sRANKL50ng/ml、青霉素100单位/ml和链霉素100ug/ml。将细胞播种于96孔培养板（4行6列）中，每孔加入浓度为4.5×104cells/ml的细胞悬液150ul。将培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养，培养5天。
　　 1.2、药物的添加:将配好浓度的细胞播种在经灭菌处理的96孔培养板中（共4行6列），将第一列作为本次实验的对照组，不添加药物。第二至五列依次加入紫杉醇，其浓度分别为10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L。每个浓度每列添加4孔。
　　 2、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色:细胞培养至第5天后行TRAP染色（按试剂盒说明操作），然后在倒置光镜下观察，计算TRAP染色阳性细胞数。观察紫杉醇对破骨前驱细胞的抑制作用。
　　 3、流式细胞术检测细胞凋亡:
　　 3.1、细胞培养:将复苏后拟用于流式细胞检测的细胞继续培养，待培养瓶底的细胞密度达到90％以上时，从培养箱内取出，用1％胰酶+EDTA消化细胞，然后加入含10％胎牛血清的α-MEM培养液8ml吹打混匀使细胞重悬，收集细胞至15ml离心管内离心5分钟（1000转/分），然后弃去上清液，再次加入含10％胎牛血清的α-MEM培养液5ml，吹打混匀后形成单细胞悬液，用细胞计数板算出此时细胞原液浓度，然后再根据公式配制成目的浓度为4.5×104cells/ml的细胞悬液，并向配置好的细胞悬液中加入sRANKL50ng/ml、青霉素100单位/ml和链霉素100ug/ml。将加好细胞因子及双抗的细胞悬液播种于24孔板的两孔中，每孔加入500μl浓度为4.5×104cells/ml的细胞悬液。
　　 3.2、药物的添加:在24孔培养板第一孔为对照组，不添加任何药物。第二孔选取行TRAP染色后对破骨前驱细胞形成抑制最明显的紫杉醇浓度为添加药物组（本实验选用10-5mol/L）。
　　 3.3、流式细胞术检测细胞凋亡:细胞培养至第5天，用1％胰酶+EDTA消化细胞并将细胞重悬，然后分别收集到两个离心管中，其中一管为对照组另一管为加药组，放入离心机内离心5分钟（1000转/分），弃上清液。然后添加4℃保存的PBS缓冲液8ml，吹打混匀使细胞成单细胞悬液，再次离心5分钟（1000转/分），弃上清液。以300μl1x缓冲液将细胞重悬，每管加入Annexin(Ⅴ)5μl、Pi10μl，静置30分钟，再加入200μl1x缓冲液，立刻将细胞置于流式细胞仪依次检测添加药物后培养至第5天的细胞凋亡情况。
　　 4、统计学分析:使用SPSS13.0软件进行统计学分析。数据处理采用非参数检验的方差分析和S-N-K检验。
　　 结果:
　　 1、破骨前驱细胞的形态学特征:细胞培养第一天各组未见破骨细胞形成;第二、三天可见有少量破骨细胞形成;第五天时各组均可见到破骨前驱细胞。行TRAP染色后镜下可见到大量染色阳性细胞，其形态学特征为:细胞体积较小，形态不规则，呈椭圆形、梭形、条索状或不规则形:胞浆丰富，呈紫红色，细胞核较小，数目多为1-2个，偶可见到3核者。
　　 2、紫杉醇对破骨细胞的形成和分化具有抑制作用。在同等条件下，药物浓度越低则形成的破骨细胞数目越多。培养板第一列是对照组没有添加药物，形成破骨细胞最多;第二列加入的浓度为10-5mol/L紫杉醇，形成的破骨细胞最少;第三、四、五、六列加入紫杉醇的浓度分别为10-6、10-7、10-8、10-9mol/L，形成破骨细胞的数目依次增多，与第一列相比统计学有显著性差异(P＜0.05），说明紫杉醇对破骨细胞的形成和分化具有抑制作用。
　　 3、紫杉醇抑制破骨细胞的形成和分化是通过细胞凋亡途径实现的。重复3次的流式细胞检测结果显示:对照组的散点图大部分均分布在Q3象限，以正常细胞为主;实验组（加药组）的散点图在Q2和Q4象限明显增多，说明加药后促进了中晚期细胞凋亡。因此，根据检测结果判明:紫杉醇是通过细胞凋亡途径抑制破骨细胞的形成和分化的。
　　 结论:
　　 1、紫杉醇可以抑制破骨细胞的形成和分化。
　　 2、紫杉醇抑制破骨细胞的形成和分化是通过细胞凋亡途径实现的。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 实验方法

3 统计学分析

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 紫杉醇及破骨细胞的相关性研究

致谢

个人简历