创作性脑损伤的基础研究及相关脑脊液漏的临床治疗

摘要

创伤性脑损伤(TBI)是全世界死亡和伤残的首要原因。颅脑创伤所导致的脑代谢紊乱是严重威胁生命的重要原因，对其进行广泛而深入的研究有着重要的现实意义。事实上目前许多常用的模型与人类所发生的外伤在受力与外部条件上是有差别的。实验模型常常应用头部固定打击，开颅手术后打击，延长麻醉时间等方法，这些都会对颅脑损伤的发展产生影响，减少继发性损伤，限制了颅内压(ICP)的监测。我们目前制作了一种新的加速打击脑外伤小鼠模型，称为打击运动模型。此模型不需长时间麻醉，不用限制头部运动，无需开颅手术，可以进行颅内压监测。损伤的严重程度可以通过气动冲击力来严格控制，设置不同的压力可以产生高度一致的轻微、中度或重度颅脑损伤。通过观察不同损伤程度的特征性病理组织学改变和行为缺陷，我们发现轻度脑外伤后动物表现出广泛的皮质和皮质下胶质细胞增生。虽然没有证据显示明确的皮质中断，血脑屏障开放，颅内压的变化或任何可察觉的认知障碍，但是相比中重度脑外伤模型，轻度脑外伤动物表现出的短暂的脑白质萎缩，弥漫性轴索损伤和神经元减少。并且轻度脑损伤出现一定程度的慢性感觉障碍伴随弥漫性神经损伤，这一结果强调了打击运动模型与目前现有的脑损伤模型相比有很大的进步，它使得我们可以对不同损伤程度的脑外伤(TBI)模型通过病理生理的研究进行有效评估。同时颅脑外伤后脑脊液漏临床十分常见，我们对颅脑外伤后造成的脑脊液漏进行引流途径的研究并通过对额窦骨折造成的脑脊液鼻漏应用新的方法进行有效的临床治疗。
　　 第一部分，创伤性脑损伤后小鼠脑白质变性、神经元缺失及行为学变化的研究
　　 目的:
　　 建立小鼠轻度，中度或重度颅脑创伤实验模型，对损伤后脑组织进行组织学及行为学改变进行分析研究。评估脑损伤后脑组织及血脑屏障破坏程度，神经元缺失及轴突变性，并对损伤后小鼠行为学改变进行分析研究。
　　 方法:
　　 所有实验中均采用雄性C57BL/6小鼠，乙醚诱导麻醉后应用改良控制性皮质损伤设备(CCI)造成大脑创伤，采用不同的打击速度制作不同程度的脑创伤模型，轻度4.8米/秒，中度5.2米/秒和重度5.6米/秒。应用2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色评价TBI后脑损伤的体积;伊文氏蓝外渗技术评估血脑屏障破坏程度;免疫组化染色观察创伤后脑部不同部位星形胶质细胞，微小胶质细胞，髓鞘碱性蛋白，磷酸化神经纤维，神经元的变化;干重-湿重法评估脑水肿的演变过程;并对颅内压及脑电活动进行监测，进行一系列行为学测试。
　　 结果:
　　 1、打击运动颅脑损伤模型的成功建立
　　 打击运动颅脑损伤模型首先的特点在于可以造成三种不同严重程度的损伤。仅需乙醚诱导麻醉后，迅速完成打击过程（平均19.9±1.9秒，17-24秒，N=26）。轻度脑外伤动物的觉醒时间与对照组动物没有显著差异，而中度和重度脑外伤动物表现出明显的苏醒延迟（P＜0.01）。轻度到重度运动打击模型从麻醉到苏醒的整体时间范围为4.5-6.5分钟。未发现有造模过程导致急性死亡。366只小鼠造模共有16只死亡，其中轻度1只，中度1只，重度14只。
　　 2、损伤后不同程度组织破坏及血脑屏障的改变
　　 2.1、重度损伤组发现10.8％(16/148)有明显凹陷性颅骨骨折，但在轻度或中等损伤组没有观察到颅骨骨折。中度和重度组发现同侧硬膜下和/或蛛网膜下腔出血、明显挫伤，往往累积深部皮层及相关脑白质。
　　 2.2、脑外伤24小时后伊文氏蓝染色，轻度损伤组并没有表现出明显的损伤，而中度损伤只表现在小的损伤灶。相比轻度和中度损伤，重度脑外伤导致显著的大范围组织损伤与缺失，占对侧半球的体积近75％。
　　 3、损伤后反应性胶质细胞的演变
　　 轻度脑外伤动物，弥漫GFAP和CD68免疫标记仅在局部受损伤一侧表达，穿透深度的皮质，皮质下白质，涉及纹状体，活化的小胶质细胞与反应性星形胶质细胞区域重叠，但一般仅限于皮层表面。3天后轻度胶质细胞增生并在第7天达到高峰。14天仍有表达，但在TBI后28天大部分消失。轻度脑外伤动物在任何时间点未发现明显胶质瘢痕或对侧脑损伤。重度脑外伤与中度的伤害相类似，但范围更加广泛，涵盖了同侧皮质，皮质下白质，纹状体和海马前部。对冲性损伤也明显位于皮质纹状体且范围更大。
　　 4、损伤后神经元缺失和轴突变性
　　 4.1、NeuN缺失轻度损伤后在任何时间点没有发现皮质或皮质下体积改变。中度损伤后，皮层组织中神经元第7天开始减少。轻度损伤组在内的所有不同程度脑损伤在3天和7天均有明显的神经元缺失，但不同损伤等级之间并没有统计学差异。重型颅脑损伤的动物除了组织的破坏和萎缩外，类似的损失是显而易见的，并且不同损伤组均有着剂量依赖性。
　　 4.2、免疫标记磷酸化神经丝(SMI-34)，伤后14天通过对免疫磷酸化神经纤维(SMI-34)的观察分析发现同侧皮质和皮层下白质存在轴突变性。中度头部外伤后轴突变性更广泛，轻度脑外伤动物也可以观察到。
　　 4.3、髓鞘碱性蛋白(MBP)在中度脑外伤后14天GFAP阳性免疫反应周边区域，MBP在皮质的表达较对侧镜像区相对中断和不连续，重度损伤后14天皮质脱髓鞘更加严重。
　　 5、脑水肿轻度损伤模型在任何时间点均未发现脑水肿。相比之下，重度损伤模型脑组织同侧和对侧半球含水量在1和3天显著升高，而中度损伤后只在同侧半球有显著升高。对侧并没有表现出显著的脑水肿。在脑外伤7天后，重型颅脑损伤的对侧和中型颅脑损伤的同侧脑水肿均消退，但重型颅脑损伤动物的同侧仍升高。
　　 6、颅内压(ICP)中度损伤后ICP迅速增加并在伤后3天达到顶峰。除了ICP峰值和谷值均相对增高外，受伤后1天ICP脉搏波振幅也显著升高。基本在伤后4-6天回复正常水平。
　　 7、外伤后癫痫发作的评价脑电活动在更高的频段上没有明显改变，没有检测到创伤后癫痫样活动，且在发生在尖峰内的癫痫样活性增强没有统计学意义。
　　 8、行为学评估
　　 8.1、神经学评分
　　 模型组在伤后3小时后表现出显著的神经功能损伤，中度和轻度损伤相对重度损伤分数要高，轻度脑外伤动物恢复快，24小时后基本恢复正常水平，中度在3天之间恢复，重型颅脑损伤的动物伤后3至7天逐渐恢复。
　　 8.2、旋转试验（Rotarodtest）对照组动物协调性有明显提高，反映除了运动学习性能外完整的运动协调性。相比之下，中/重度TBI动物未能改善，一周后表现出持续的运动功能缺陷。
　　 8.3、旷场试验对照组与各模型组无统计学意义。从而说明了在创伤性脑外伤中旋转实验反应了受损的运动学习功能而不是简单的运动缺陷。
　　 8.4、新奇物识别实验在全程五周实验中对照组动物表现出稳定的对新物体的识别，轻度损伤表现正常，然而中度/重度TBI动物表现出对新事物辨识显著和持续的下降。
　　 8.5、巴恩斯迷宫(Barnesmaze)实验脑外伤28天后。在连续3天的实验，对照组小鼠完成实验的时间明显缩短。轻度损伤小鼠与对照组相比无明显差别，然而中度/重度脑外伤小鼠表现出明显的认知障碍(P＜0.05)。此外，与新奇物识别实验测试结果一致，轻度脑外伤动物没有表现出任何的认知缺陷，中度和重度TBI表现出长期运动和认知功能障碍。
　　 结论:
　　 新TBI模型具有以下特点:(1)小鼠在受到打击后头部和身体可以自由运动，受力机制类似于现实生活中的意外伤害。(2)无需进行任何造模前的手术准备;(3)小鼠只需2-3min的诱导麻醉;(4)颅骨仍然闭合，避免颅骨骨折;(5)损伤程度可控性，包括轻度脑损伤特点:广泛的胶质细胞增生和脑白质变性。总体而言，这种简单的模型以造成稳定的脑白质病变伴随神经元的缺失，对不同程度损伤后的脑代谢改变的深入研究有重要意义，将对神经保护性试验研究产生十分有利的作用。
　　 第二部分，创伤性脑损伤(TBI)后水通道蛋白(AQP4)功能失调的动态改变及星形胶质细胞反应区域AQP4表达的复杂变化
　　 目的:
　　 研究轻度及中度颅脑损伤后AQP4的动态改变和星形胶质细胞反应区域AQP4表达的复杂变化。
　　 方法:
　　 10-12周龄的雄性C57BL/6小鼠，应用改良控制性皮层打击设备造模，通过免疫组化染色分析胶质纤维酸性蛋白（GFAP），小胶质细胞(CD68)，神经元标记物(NeuN)，神经丝蛋白磷酸化标记物(SMI-34)，水通道4(AQP4)和髓鞘碱性蛋白(MBP)损伤后的变化。
　　 结果:
　　 1、轻、中度颅脑创伤模型的建立'轻度'和'中度'的脑损伤皮质撞击速度为4.8米/秒和5.2米/秒，深度和接触时间均保持不变（见第一部分）。
　　 2、创伤后胶质细胞反应性改变
　　 轻度脑外伤动物3天伤后，打击部位星形胶质细胞(GFAP)和小胶质细胞(CD68)弥漫反应性增生(Fig.1B)。轻度脑外伤动物在任何时间点没有明显的胶质瘢痕出现，皮质改变在中度损伤后3天明显7天达到高峰，在7天形成明确的胶质瘢痕。
　　 3、TBI后脱髓鞘和轴突变性
　　 轻度损伤在任何时间点没有发现明显的皮质或皮质下体积改变(Fig.2A-B)，中度损伤后，皮层组织在伤后第7天出现改变(Fig.2A*P＜0.05比对照)。轻度和中度头部外伤，包括胼胝体，外囊，皮质下白质有短暂的萎缩，在伤后第7天达到高峰（Fig.2C*P＜0.05vs.对照）在14天趋于稳定。在胶质原纤维酸性蛋白免疫反应性的中度病变周围的区域，MBP较对侧表达明显减弱。（Fig.2D-F;*P＜0.05vs.对照组）。磷酸化神经纤维(SMI-34)在伤后14天出现同侧皮质和皮质下白质轴突变性。轻度损伤也出现广泛轴突变性，但中度损伤更为明显(Fig.2I)。
　　 4、颅脑损伤后AQP4在局部的皮层和纹状体的表达发生复杂的变化。轻度损伤中AQP4在全脑的表达与血管周围AQP4表达均有明显减少。损伤后7天胶质瘢痕的形成使得AQP4上调表达增加，且AQP4的表达失调与星形胶质细胞反应性改变有关。
　　 结论:
　　 创伤后反应性星形胶质细胞AQP4表达表现出明显的去极化，AQP4失调可能并不导致创伤后脑水肿和ICP的变化发展，而可能是一种代偿性反应。从轻度颅脑损伤后反应性星形胶质形成伴随AQP4功能失调来看，可以针对胶质细胞增生的治疗途径使AQP4表达正常化，减少中度或重度脑外伤创伤后癫痫发作的易感性，有利于脑内代谢废物的清除。
　　 第三部分，颅脑损伤后(TBI)脑脊液漏的基础研究及临床治疗
　　 目的:
　　 对颅脑外伤后造成脑脊液漏进行引流途径研究并对额窦骨折造成的脑脊液鼻漏通过经皮注射纤维蛋白胶治疗的方法进行临床评估。
　　 方法:
　　 影像学分析额窦鼻腔开口及其解剖学相关引流途径，对目前颅脑创伤所导致的难治性脑脊液鼻漏进行影像学定位诊断，并分析经皮注射纤维蛋白胶治疗额窦骨折脑脊液鼻漏的方法进行围手术期观察及预后的评估。
　　 结果:
　　 对颅脑创伤导致额窦脑脊液鼻漏的基础研究有助于发现新的治疗途径。经皮穿刺注射纤维蛋白胶是有效治疗额窦脑脊液鼻漏的新方法。手术时间为27.6±7.98分钟，平均住院为11.25±4.99天，随访平均为11.5个月未见复发。
　　 结论:
　　 对颅脑创伤导致额窦脑脊液鼻漏的基础研究有助于发现新的治疗途径。应用经皮穿刺纤维蛋白胶注射法治疗脑脊液鼻漏，只需要HRCT下检查额窦前后壁骨折情况定位漏口。此技术高效，损伤小，有利于临床推广，同时也表明基础研究对临床指导的重要性。

目录

声明

摘要

ABSTRACT

英文缩写

INTRODUCTION

Part 1 White matter degeneration，neuronal loss and behavior deficit in the modified CCI model of traumatic brain injury(TBI)

INTRODUCTION

MATERIALS AND METHODS

RESULTS

FIGURES

DISCUSSION

CONCLUSION

REFERENCES

Part 2 Complex patterns of AQP4 disorder after closed-skull Traumatic brain injury(TBI)

INTRODUCTION

MATERIALS AND METHODS

RESULTS

FIGURES

APPENDIX

DISCUSSION

CONCLUSION

REFERENCES

Part 3 Anatomical study and clinical treatment of frontal sinus cerebrospinal fluid rhinorrhea after trauma brain injury(TBI)

INTRODUCTION

Materials and Methods

RESULT

FIGURES

APPENDIX

DISCUSSION

CONCLUSION

REFERENCES

CONCLUSION

综述 颅脑创伤动物模型的研究进展

致谢

个人简历