HERG通道开放剂ICa-105574抗心室复极延迟所致心律失常和心肌肥厚作用研究

摘要

长QT综合征(long QTsyndrome，LQT)以心室肌细胞复极化延长为特征，心电图上表现为QT间期延长，容易产生室性心律失常，尤其是尖端扭转型室性心动过速。HERG基因(humanether-a-go-go-relatedgene)编码心脏延迟整流钾电流快速成份IKr的α亚单位，IKr在动作电位复极化过程中发挥重要作用。HERG基因突变或药物诱导的阻断使IKr减少，产生遗传性和获得性LQT。因此，一个潜在的治疗LQT的方法就是药物直接作用于靶点，通过激活HERG通道而增加复极电流。近年来在筛选药物对HERG通道影响的过程中发现了一些小分子化合物可以通过不同作用机制激活HERG通道，包括主要减慢去活的Ⅰ类和主要影响失活的Ⅱ类HERG通道开放剂。目前尚不十分清楚哪类开放剂对于治疗QT延长诱发的心律失常更有效。最近，Zhang等报道主要影响失活的HERG通道开放剂可剂量依赖性的缩短LQT1病人来源的干细胞定向分化心肌细胞的动作电位时程(actionpotentialduration，APD)，而主要减慢去活的HERG通道开放剂却无效。早期文献也证明目前的Ⅰ类HERG通道开放剂RPR260243仅在高浓度时（30μM）缩短APD。上述结果提示，减少电压依赖性失活的Ⅱ类HERG通道开放剂对于调节APD更有效，可能具有更好的潜在抗心律失常作用。
　　 迄今，已报道的Ⅱ型HERG通道开放剂包括NS1643，NS3623，PD-118057，PD-307243，A-935142和ICA-105574，虽然在细胞水平这些开放剂增大电流和缩短APD的作用已被证实，但在整体心脏水平上述开放剂对复极延迟所致心律失常的影响报道很少。化合物NS1643是目前研究最全面的开放剂之一，在获得性LQT家兔模型和低钾灌流的小鼠心脏上已表现出明显的抗心律失常作用。化合物ICA-105574是迄今为止发现的作用最强大的HERG通道失活抑制剂，在异源表达的HEK293细胞上它可以使HERG电流增加12±3倍，且能大大缩短豚鼠心肌细胞的APD。新近有文献报道ICA-105574能显著缩短离体豚鼠心脏和麻醉犬的单相动作电位以及QT间期。但是ICA-105574对抗病理性APD延长和复极延迟所致心律失常的有效性尚未见报道。
　　 心肌肥厚、心衰时，电生理重构的一个主要特征是APD延长，继发QT间期延长，并伴有高发心律失常的风险。心衰时APD延长的主要原因包括晚钠电流（INaL），L-型钙电流（ICaL）的增加以及复极外向钾电流如瞬时外向钾电流(Ito)，IKs和IKr的下调。而病理情况下引发上述离子通道机能改变的机制还不完全清楚。研究显示，心肌α、β、AT1、内皮素等受体激动可直接调控心肌多种离子通道机能。已知上述受体及其信号转导通路的激活在心肌肥厚性组织重构中发挥重要作用，提示病理情况下上述信号通路的激活也是心肌电生理重构的原因。迄今，对于肥厚性组织重构与电生理重构的因果关系尚无明确定论。传统上心肌电重构被认为是心肌肥厚或心衰的结果，但有实验表明，电生理重构先于组织重构。有实验表明，心脏特异性过表达内皮素ET-1导致的心脏传导障碍先于心衰的发展，心脏过表达AT1受体的幼年小鼠，电生理的改变先于细胞肥厚的发生。已知细胞内Ca2+信号通路在心肌肥厚、心衰的发展过程中发挥关键作用。APD延长增加L-型Ca2+通道开放时间，使得细胞内Ca2+增加，可能是组织重构的重要机制，对抗病理情况下APD延长可望抑制肥厚性重构。然而迄今为止，调控离子通道药物对心肌肥厚性重构的实验研究报道很少。有实验显示，to下调和其所致的APD延长是苯肾上腺素(PE)激活α受体引发新生大鼠心肌细胞(NRVMs)肥大的主要机制，APD延长导致的Ca2+内流的增加通过钙调神经磷酸酶(Calcineurin)信号通路激活肥厚相关因子，过表达编码Ito的基因Kv4.2可以阻止PE引发的细胞肥大，此实验提示促进动作电位复极可对抗心肌细胞肥厚性重构。IKr是晚期复极的重要电流成分，其机能变化对APD的长短发挥重要影响，增加HERG电流促进复极是否影响心肌细胞肥厚尚未见报道。
　　 本课题旨在研究化合物ICA-105574对抗HERG通道阻断、病理性APD延长以及延迟复极所致心律失常的有效性，同时，其作用同另一个抑制通道失活作用较弱的化合物NS1643进行比较，以确定此类HERG通道开放剂抗心律失常作用是否和抑制失活的强度有关。此外，还评价了ICA-105574在NRVMs上对抗佛波酯(PMA)诱导的细胞肥厚的影响，为HERG开放剂的开发和应用提供实验依据。
　　 第一部分，HERG通道开放剂ICA-105574对药物抑制IKr和APD延长的逆转作用研究
　　 目的:观察ICA-105574和NS1643对药物抑制HERG电流和动作电位的逆转作用以及对豚鼠心室肌动作电位特征的影响。
　　 方法:在稳态转染HERG基因的HEK293细胞上，利用全细胞膜片钳技术记录HERG电流，观察ICA-105574和NS1643对多菲利特和莫西沙星抑制电流的影响。细胞钳制在-80mV，去极化至20mV，维持4s，然后电压复极至-60mV，诱发较大的缓慢延迟的HERG外向尾电流。利用动作电位钳技术，记录HERG电流，以单个室性动作电位波刺激诱发HERG电流，每秒一次。实验在室温(20℃～25℃)下进行。记录HERG电流的溶液:电极内液(mmol/L):KCl140，Mg-ATP4，MgCl21，EGTA5，HEPES10，用KOH调pH至7.2。电极外液(mmol/L):NaCl140，KCl5.4,MgCl21,CaCl22,glucose10,HEPES10用NaOH调pH至7.4。
　　 在豚鼠心室肌细胞上，利用打孔膜片钳技术记录动作电位，观察不同浓度ICA-105574和NS1643对正常豚鼠心肌细胞动作电位的作用以及对频率依赖性的影响，还观察了ICA-105574和NS1643对药物诱发APD延长的作用。电流钳制在0，向细胞内注入2.0nA的电流，维持4ms，然后再回到0，以不同频率诱发动作电位，进行记录。实验在36℃～37℃下进行。记录豚鼠心室肌动作电位的溶液:电极内液成分为(mM):谷氨酸钾120,KCl25,MgCl21,CaCl21,HEPES10(pH7.4withKOH);电极外液成分为(mM):NaCl138，KCl4，MgCl21，CaCl22，NaH2PO40.33,glucose10andHEPES10(pH7.4withNaOH)。
　　 结果:(1)10nM多菲利特和100μM莫西沙星对激活电流和尾电流均有明显的抑制作用，应用1μMICA-105574后，对激活电流的抑制均有非常明显的逆转，逆转作用均达4-5倍以上，但对尾电流的作用不很明显。应用10μMNS1643后，对激活电流和尾电流的抑制均有明显的逆转。另外，利用动作电位钳技术，我们发现ICA-105574和NS1643均可逆转多菲利特和莫西沙星对HERG电流的抑制作用，但是NS1643几乎不改变动作电位钳记录的HERG电流的“hump”形状，仅使被抑制的电流的峰值增加，而ICA-105574不仅使HERG电流的峰值增加，也使初始相的电流大大增加，使电流呈现AP样形状。
　　 (2)ICA-105574和NS1643均可浓度依赖性的缩短豚鼠心肌细胞动作电位，但ICA-105574的作用明显强于NS1643，而且10μMICA-105574使6个细胞中的3个细胞的动作电位消失。经Hill方程拟合APD50和APD90的浓度依赖性关系曲线，ICA-105574缩短APD50的最大效应值和IC50分别是100.6±0.3％和2.6±0.1μM。NS1643缩短APD50的最大效应值和IC50分别是52.1±1.0％和4.7±0.1μM。ICA-105574缩短APD90的最大效应值和IC50分别是95.5±0.1％和2.1±0.1μM，NS1643缩短APD50的最大效应值和IC50分别是48.5±1.0％和4.9±0.1μM。结果表明ICA-105574缩短APD的作用明显强于NS1643。
　　 (3)在不同频率下(0.3Hz、1Hz、3Hz)，不同浓度的ICA-105574和NS1643都能明显缩短APD90。ICA105574的浓度达到3μM时，频率依赖性几乎消失，而NS1643几乎不影响频率依赖性。
　　 (4)应用IKr抑制剂多菲利特(10nM)和莫西沙星（100μM）、IKs抑制剂Chromanol293B（10μM）和低钾（2.1mM）灌流均可使动作电位不同程度延长，这种延长作用可被3μMICA-105574或10μMNS1643逆转，但两者均不影响静息电位和动作电位幅值。
　　 小结:ICA-105574和NS1643均可对抗HERG抑制剂引起的电流减少，二者可以浓度依赖性的缩短豚鼠心室肌细胞APD，并可对抗LQT1和LQT2病理性APD延长。上述作用ICA-105574强于NS1643。
　　 第二部分，HERG通道开放剂ICA-105574抗心脏复极延迟所致心律失常作用的研究
　　 目的:观察ICA-105574对IKr或IKs抑制剂引起的心律失常的对抗作用，并平行比较NS1643的抗心律失常作用，以确定抗心律失常作用是否和移除失活的作用成正比，另外也研究了两者潜在的致心律失常作用。
　　 方法:将两个电极放在离体Langendorff灌流心脏的心尖和主动脉根部，通过BIOPAC/MP100多道生理测定系统记录ECG。实验程序如下:(1)为观察ICA-105574和NS1643潜在的致心律失常作用，首先心脏稳定1h以保证记录到稳定的ECG之后灌流0.1％DMSO20分钟作为溶剂对照，再从低浓度开始依次分别灌流不同浓度(1、3、5和10μM)的测试药物，观察心律失常包括室颤(VF)和室性心动过速(VT)的发生，室速确定为连续三个以上的室性期前收缩。(2)通过两个LQT1和LQT2的药理学模型研究ICA-105574和NS1643的抗心律失常作用。IKr或100μMIKs。抑制剂（莫西沙星、chromanol293B）合并低钾(2.1mM)诱发心律失常。Langendorff心脏首先灌流0.1％DMSO10分钟，然后预灌流10分钟测试药物，之后一并低钾条件下灌流莫西沙星或chromanol293B60分钟以上，观察ICA-105574和NS1643对心律失常的预防作用。(3)莫西沙星或chromanol293B合并低钾(2.1mM)诱发心律失常后，再加入不同浓度的ICA-105574或NS1643，观察它们对心律失常的对抗作用。
　　 结果:(1)3、5和10μMICA-105574能显著缩短QTc，使QWc从182.2±5.1ms分别缩短至140.5±10.2ms(n=6，p＜0.01)、123.8±11.0ms(n=6，p＜0.01)和113.2±6.4ms(n=6，p＜0.01)。心电图中另一个显著的外观表现是应用ICA-105574后T波出现明显倒置，且倒置波幅度呈现浓度依赖性。在6例心脏中，10μMICA-105574诱发2例出现了VT。5和10μMNS1643也能邑明显缩短QTc，使QTc从180.5±4.0ms分别缩短至160.7±10.2ms(n=6，p＜0.01)和146.4±11.2ms(n=6，p＜0.01)。但NS1643没有明显改变ECG的各波型。、
　　 (2)莫西沙星(100μM)在低钾条件下8例心脏中4例出现VT或VF，Chromanol293B(10μM)在低钾条件下10例心脏中5例出现VT或VF。而在提前预灌流ICA-105574（3μM）后，莫西沙星或Chromanol293B均未诱发心律失常;但是，预灌流NS1643（10μM）后，莫西沙星8例心脏中2例出现心律失常，而Chromanol293B10例心脏中8例出现心律失常。
　　 (3)莫西沙星或chromanol293B在低钾灌流下一旦诱发心律失常，不同浓度的ICA-105574(1、3、5μM)和NS1643（3、5、10μM）均不能终止VT或VF。
　　 小结:在离体豚鼠心脏，ICA-105574而不是NS1643，可以预防LQT1和LQT2引发的室性心律失常，但对已经发生的室性心动过速，两个化合物均无治疗作用。此外，高浓度ICA对正常心脏具有潜在的致心律失常作用。因此，开发此类HERG通道开放剂时，其抗心律失常作用和潜在的致心律失常风险都需要考虑。
　　 第三部分，HERG通道开放剂ICA-105574抗心肌肥厚的作用研究
　　 目的:评价HERG开放剂ICA-105574在NRVMs肥厚细胞模型上的作用。
　　 方法:实验选用新生1-2天的健康Sprague-Dawley大鼠乳鼠，0.125％胰蛋白酶消化，收集细胞，首先用差速贴壁法去除非心肌细胞，最后调整细胞密度为1×105个/ml，用含10％胎牛血清和0.1mMBrDU的DMEM-F12培养基于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。加药前细胞在无血清培养基DMEM-F12中孵育24h。实验分组:control组、ICA-105574(0.3、1、3μM)组、PMA(1μM)、PMA+ICA-105574(0.3、1、3μM)组，共同孵育48h后进行以下实验:
　　 (1)绿色荧光探针(DiO)标记细胞膜，利用激光共聚焦显微镜观察细胞形态，使用标尺工具测量心肌细胞表面积，进一步利用膜片钳记录计算出细胞膜电容，观察ICA-105574对PMA诱发的细胞肥大的影响。
　　 (2)利用RT-PCR测定心肌细胞中肥厚相关因子脑钠肽(BNP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)的mRNA水平。
　　 (3)膜片钳电生理记录:采用全细胞膜片钳技术记录新生大鼠心室肌细胞动作电位。电流钳制在0，向细胞内注入2.0nA的电流，维持1ms，然后再回到0，以1HZ频率诱发动作电位，进行记录。电极内液成分为(mM):KCl135,EGTA10,MgCl21,MgATP5,HEPES10，用KOH调pH至7.2。电极外液成分为(mM):KCl5，NaCl130，MgCl21，CaCl22，glucose10，HEPES10，用NaOH调pH至7.4。NRVMsCs-IKr电流记录:细胞钳制在-80mV，从-70mV开始以阶跃电压10mV的方式逐步去极化至70mV，维持1s，然后电压复极至-80mV，诱发Cs-IKr尾电流。电极内液(mmol/L):CsCl135,EGTA10,MgATP5,HEPES10，用CsOH调pH至7.2。电极外液(mmol/L):CsCl135，MgCl21，glucose10，HEPES10，nimodipine10μM，用CsOH调pH至7.4。
　　 结果:(1)ICA-105574对PMA诱发的细胞肥大的影响:PMA孵育48小时可使细胞表面积增加179±38％(P＜0.05，n=24cells)，单独孵育ICA-105574后，细胞表面积没有明显变化;而同时孵育0.3、1、3μM的ICA-105574后，细胞表面积分别降低至135±23％(P＜0.05，n=22cells)、113±28％(P＜0.05,n=39cells)和105±24％(P＜0.05,n=28cells)。1μMPMA可使细胞膜电容从31±4pF增加到72±13pF(P＜0.05，n=20cells)，单独孵育ICA-105574后，细胞膜电容没有明显变化。而同时孵育3μMICA-105574后，细胞膜电容降至35±11pF(P＜0.05，n=20cells)。
　　 (2)NRVMs孵育PMA(1μM)48小时后，与对照相比，BNP、β-MHC的mRNA表达水平均升高(P＜0.05，n=6)。在1、3μM的ICA-105574预处理的情况下，PMA引起的BNP表达水平都有一定程度的下降，明显低于单纯PMA模型组(P＜0.05，n=6)，并呈现浓度依赖性(Fig.4B)。同样，在0.3、1、3μMICA-105574预处理的情况下，PMA引起的β-MHC表达水平也均明显下降，明显低于单纯PMA模型组(P＜0.05，n=6)，并呈现浓度依赖性(Fig.4D)。而单独用不同浓度的ICA-105574(0.3、1、3μM)处理，BNP、β-MHC表达水平与对照组比较没有显著性变化(Fig.4Aand4C)(P＞0.05，n=6)。
　　 (3)动作电位变化:与对照相比，PMA(1μM)可显著延长NRVMs的APD，对照细胞的APD50和APD90分别为160.2±16.5ms和250.2±16.6ms，PMA处理细胞分别延长至225.7±23.3ms(n=8，P＜0.01)和310.8±23.5ms(n=8，P＜0.01);应用ICA-105574(3μM)后APD50并口APD90又分别缩短至187.3±17.6ms(n=8，P＜0.01)和275.2±17.3ms(n=8，P＜0.01)。提示ICA-105574能够对抗PMA引起的动作电位延长。
　　 (4)Cs-IKr电流变化:在-30～70mV范围内3μMICA-105574可明显增大正常心肌细胞的Cs-IKr电流。随着电压的增大，3μMICA-105574增大CS-IKr电流的作用逐渐增加，说明ICA-105574增大Cs-IKr电流具有一定的电压依赖性，且ICA-105574缩短NRVMs动作电位的作用与增大Cs-IKr电流有关。
　　 小结:当前的研究结果表明，ICA-105574可以对抗PMA引起的新生大鼠心肌细胞肥大，这种对抗作用是由ICA-105574增大IKr电流、缩短动作电位产生的。其机制可能与其缩短动作电位，改变细胞内钙处理有关。具体机制有待进一步研究。
　　 结论:1、ICA-105574和NS1643均可对抗HERG抑制剂引起的电流减少，并可对抗LQT1和LQT2病理性APD延长。上述作用ICA-105574强于NS1643。
　　 2、在离体豚鼠心脏，ICA-105574而不是NS1643，可以预防药物致LQT1和LQT2引发的室性心律失常，但对已经发生的室性心动过速，两个化合物均无治疗作用。
　　 3、高浓度ICA对正常心脏具有潜在的致心律失常作用。开发此类HERG通道开放剂时，应考虑其潜在的致心律失常风险。
　　 4、ICA-105574可以对抗PMA引起的新生大鼠心肌细胞肥大，可能与其缩短动作电位有关。具体机制有待进一步探讨。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 HERG通道开放剂对药物抑制Ikr和APD延长的逆转作用研究

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分 HERG通道开放剂ICA-105574抗心脏复极延迟所致心律失常作用的研究

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分 HERG通道开放剂ICA-105574抗心肌肥厚作用的研究

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述 HERG钾通道开放剂及其潜在抗心律失常作用研究进展

致谢

个人简历