大鼠弥漫性脑创伤后NADPH氧化酶对海马CA1区神经元自噬调节的分子机制研究

摘要

创伤性脑损伤(Traumatic brain injury, TBI)是由外力导致脑组织严重受损的疾病，具有高发病率、高死亡率和高致残率等特点，且患者多数是青壮年，幸存者大部分遗留有不同程度的神经和心理方面的功能障碍，给家庭和社会带来沉重的精神和经济负担。但是目前来讲，TBI的治疗手段比较有限，因此深入研究TBI后的生理病理机制改变、寻找新的有效治疗靶点一直是TBI研究的热点与难点。
　　 TBI后导致进一步脑损害发生的主要病理机制是继发性脑损伤（Secondary brain injury, SBI），继发性脑损伤发生于受伤后数分钟到数天甚至更长的时间内，它是以原发性损伤为基础逐渐发展起来的病理改变，是造成TBI后神经元损伤、乃至死亡的重要原因，因此对继发性脑损伤的治疗是改善TBI患者预后的关键。最近研究证明TBI后由氧自由基尤其超氧阴离子所引起的连锁反应是神经元受损的核心病理环节。其中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶是由多个亚基组成的酶复合体，在氧化酶正常功能的维持及氧自由基的产生过程中起着重要作用。NADPH氧化酶参与TBI后继发性脑损伤的机制还未完全阐明。在脑缺血-再灌注研究中发现NADPH氧化酶在各种因素作用下活性增加产生过多的活性氧通过各种细胞内或细胞间的信号传导途径参与脑缺血后神经元的死亡。自噬(aut ophagy)性细胞死亡作为神经细胞死亡的一种新形式，近期越来越受到关注，但是其在TBI中的作用及其信号转导的调节机制方面研究仍然不足，其信号转导通路在脑损伤后是否受到NADPH氧化酶的调节目前也不是很明确。
　　 本文拟利用改良的Marmarou方法复制大鼠弥漫性中度TBI模型，并应用NADPH氧化酶特异性抑制剂Apocynin、Akt特异性抑制剂LY294002进行预处理，探讨NADPH氧化酶活性与其催化亚单位NOX2蛋白表达的变化以及其在继发性脑损伤中的作用;同时明确NADPH氧化酶对海马神经元自噬表达的影响与其可能的调节机制，以寻找TBI后引起神经元自噬发生的信号通路上游中关键的调节靶点，为研究TBI后继发性脑损害的发生机理与临床治疗提供新的理论依据和治疗策略。本研究论文分共三部分进行阐述。
　　 第一部分大鼠弥漫性脑创伤后NADPH氧化酶活性和其催化亚单位NOX2的表达变化及在继发性脑损伤中的作用
　　 目的:检测弥漫性中度TBI大鼠海马CA1区NADPH氧化酶活性及其催化亚单位NOX2蛋白的表达变化，明确NADPH氧化酶在继发性脑损伤中的作用。
　　 方法:健康SD雄性大鼠240只数字随机分组:
　　 ①假手术组(Sham group);
　　 ②脑创伤组(TBI group);
　　 ③脑创伤+溶剂组(DMSO group);
　　 ④脑创伤+Apocynin组(Apocynin group)。
　　 采用改良的Marmarou方法复制中度TBI模型，于TBI后6h、12h、24 h、48 h、72 h等5个时间点对下列指标进行检测:
　　 ①HE染色观察脑组织CA1区病理形态学变化;
　　 ②免疫组化检测海马CA1区NOX2的蛋白表达、定位;
　　 ③Western-blot检测海马区NOX2的蛋白表达;
　　 ④光泽精比色法检测海马区NADPH氧化酶活性;
　　 ⑤干湿比重法测定脑组织水含量;
　　 ⑥另取40只SD大鼠于TBI后8、10天行Morris水迷宫测试，检测其空间学习记忆能力。
　　 应用Image Proplus 6.0和Gel-Doc软件分析系统对实验结果进行定量，所得数据使用均数±标准差（(x)±s）表示，用SPSS15.0统计软进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较采用q检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。
　　 结果:
　　 1、HE染色观察组织形态学变化:海马CA1区Sham组组织形态结构正常，神经细胞数较量多，形态完整;TBI组和DMSO溶剂组神经元胞体肿胀明显，胞浆嗜色性染色减弱，核仁皱缩浓染明显，细胞周围存在较大间隙，出现神经元变性坏死等;Apocynin治疗组神经元胞体肿胀和核仁浓缩较TBI组明显减轻，神经元周围间隙相对较小。
　　 2、NOX2免疫组化检测结果:NOX2在海马CA1区主要定位于细胞的胞膜，Sham组偶可见阳性细胞，着色较浅淡;与Sham组相比，TBI后6h起NOX2阳性细胞开始增多，着色加深，免疫反应性增强，24 h达高峰，组间差异有统计学意义(P＜0.05); DMSO组与TBI组NOX2表达组间无差异;Apocynin治疗组NOX2阳性表达趋势与TBI组和DMSO组相似，但免疫反应性明显减弱（P＜0.05）。
　　 3、海马区NOX2蛋白Western-blot检测结果:Sham组NOX2的蛋白有少量表达，且在各时间点无明显变化;TBI组与Sham组相比NOX2的蛋白表达量在伤后6h开始升高，峰值在TBI后24 h出现，后开始下降，组间差异有统计学意义(P＞0.05); DMSO组与TBI组的NOX2表达组间无明显差异，Apocynin治疗组各时间点NOX2蛋白表达趋势与TBI和DMSO组相似，但表达量明显降低（P＜0.05）。
　　 4、海马区NADPH氧化酶活性结果检测:在Sham组中NADPH氧化酶活性较低，不随时间推移而改变;TBI组和DMSO组在TBI后6h起明显升高，24 h达到高峰，后开始回落，到72 h仍然没有降至正常水平，各个时间点NADPH氧化酶的活性与Sham组相比均有统计学意义(P＜0.05);Apocynin治疗组NADPH氧化酶活性变化趋势同TBI组，与TBI和 DMSO组相比其活性明显下降(P＜0.05)。
　　 5、TBI后脑组织水含量测定:TBI后6h、12h、24 h、48 h、72 h脑组织水含量百分比分别为77.23±0.82、78.51±0.92、80.62±0.79、80.75±1.06、80.92±0.87。DMSO组各时间点含水量与TBI组相似，无统计学意义(P＞0.05)，但均明显高于假手术组74.62士0.76(P＜0.05);Apocynin干预组各时间点水含量较TBI组明显减少（P＜0.05）。
　　 6、学习记忆能力改变:使用Morris水迷宫测试检测大鼠学习记忆能力改变。 TBI组和DMSO组伤后第8天及第10天搜索安全岛潜伏期较Sham组均明显延长，组间差异有统计学意义(P＜0.01)。Apocynin组伤后第8天及第10天搜索安全岛运动轨迹、潜伏期均较TBI和DMSO组明显改善，差异有统计学意义(P＜0.05）。
　　 小结:TBI后海马CA1区NADPH氧化酶催化亚单位NOX2表达水平上调，NADPH氧化酶活性增加，加重TBI后继发性脑损伤;抑制TBI后NADPH氧化酶的激活可以明显减轻脑水肿，改善学习记忆功能障碍，具有神经保护作用。
　　 第二部分大鼠弥漫性脑创伤后NADPH氧化酶对海马CA1区神经元自噬的影响
　　 目的:探讨TBI后海马CA1区神经元是否发生自噬，并明确NADPH氧化酶是否对神经元自噬的表达存在影响。
　　 方法:采用改良的Marmarou方法复制大鼠中度TBI模型。随机分组:
　　 ①Sham组(n=45);
　　 ②TBI组(n=45);
　　 ③DMSO组(n=45);
　　 ④Apocynin组(n=45)。
　　 取伤后6h、12h、24 h、48 h、72 h共5个时间点对下列指标进行检测:
　　 ①免疫组化检测海马CA1区自噬标志性蛋白Beclin-1的表达、定位;
　　 ②Western-blot检测海马区自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值以及Beclin-1的蛋白表达;
　　 ③荧光双标检测海马CA1区LC3与神经元特异性标记物(NeuN)的表达、定位。定量分析和统计方法同第一部分。
　　 结果:
　　 1、海马CA1区Beclin-1免疫组化检测结果:Beclin-1主要定位于神经元胞质，Sham组偶见阳性表达，着色浅淡，免疫反应性不随时间推移而改变。与Sham组比较，TBI组伤后6h起Beclin-1阳性细胞开始明显增多，且着色加深，免疫反应性增强，伤后24 h达高峰，后开始下降，DMSO组与TBI组比较差异无统计学意义(P＞0.05); Apocynin治疗组Beclin-1表达趋势与TBI组相似，但阳性表达与免疫反应性明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 2、海马Beclin-1的Western blot检测结果:Sham组Beclin-1蛋白表达较低，各时间点无变化;与Sham组比较，TBI组伤后6h起Beclin-1蛋白量逐渐增加，伤后24 h达高峰，后表达逐渐下降至伤后72 h仍未达正常水平，组间差异有统计学意义(P＜0.05); TBI组与DMSO组比较Beclin-1表达变化组间无差异(P＞0.05); Apocynin治疗组Beclin-1蛋白表达时程变化与TBI组相似，但各时间点表达量明显减少(P＜0.05)。
　　 3、海马CA1区LC3的Western blot检测结果:Sham组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值在各时间点无变化;与Sham组比较，伤后6h开始TBI组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值逐渐升高，24 h达峰值，后逐渐下降，组间差异有统计学意义（P＜0.05）;TBI组与DMSO组比较差异无统计学意义（P＞0.05）;Apocynin治疗组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值变化趋势与TBI组相似，但比值明显变小，伤后6h、12h、24 h、48 h和72 h差异均有统计学意义(P＜0.05)。
　　 4、海马CA1区LC3与神经元特异性标记物(NeuN)荧光双标检测结果:激光共聚焦显微镜下可见LC3为TRITC标记的细胞核周红色荧光，NeuN为FITC标记的绿色荧光。在TBI组中可见海马CA1区神经元细胞胞浆中可见大量绿色和红色荧光重叠呈黄色聚集，说明神经元发生了自噬;Apocynin治疗组中红色荧光和绿色荧光重叠明显减少，神经元自噬表达受到抑制。
　　 小结:TBI后6h起海马CA1亚区神经元即可检测到自噬现象的发生，且自噬表达逐步增强，于TBI后24 h达峰值;使用Apocynin进行预处理可明显减轻神经元发生自噬的程度:结果表明TBI后NADPH氧化酶介导调控了海马CA1区神经元的自噬发生。
　　 第三部分大鼠弥漫性脑创伤后NADPH氧化酶对海马CA1区神经元自噬调节的分子机制研究
　　 目的:通过使用NADPH氧化酶与Akt特异性抑制剂Apocynin和LY294002进行干预处理，明确TBI后Akt/mTOR信号通路是否参与了NADPH氧化酶介导调控的海马CA1区神经元的自噬发生。
　　 方法:将270只SD大鼠随机分成6组:
　　 ①Sham组；
　　 ②Sham+LY294002组；
　　 ③TBI组；
　　 ④DMSO组；
　　 ⑤Apocynin组；
　　 ⑥Apocynin+LY294002组。
　　 每组又分别划分为伤后6h、12h、24 h、48 h、72 h等5个时间点。检测：
　　 ①HE染色观察海马CA1区组织形态改变;
　　 ②Western blot半定量检测P-Aktser-473、 p-P70S6KThr-389、 Beclin-1、 LC3的蛋白表达;
　　 ③荧光显微镜检测LC3、p-AktThr-389分别与神经元特异性标记物(NeuN)双标定位。
　　 结果分析和统计方法同前。
　　 结果:
　　 1、HE染色观察组织形态学改变:光镜下Sham组和TBI组脑组织形态结构同前;Apocynin联合LY294002治疗组在TBI后24 h可见病理形态改变较TBI组明显加重，神经元胞体肿胀明显，坏死，胞浆嗜色性染色减弱与核仁皱缩浓染更加明显。
　　 2、海马区p-Aktser-473的Western blot检测结果:Sham组p-Aktser-473蛋白表达较低，在各时间点无变化，与Sham组比较，TBI组伤后6h起p-Aktser-473蛋白量显著增高（P＜0.05），6 h-24 h表达逐渐下降，24 h后表达又缓慢增强呈双峰状，Apocynin组各时间点p-Aktser-473蛋白表达趋势变化与TBI组相似，但表达量显著增加，组间差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 3、海马区p-P70S6KThr-389的Western blot检测结果:Sham组p-P70S6KThr-389蛋白表达较低，不随时间推移而改变;与Sham组相比， TBI组伤后6h起p-P70S6KThr-389蛋白量显著增高(P＜0.05)，6 h-24 h表达逐渐下降，24 h后表达又缓慢增强呈双高峰表达，Apocynin组各时间点p-P70S6KThr-389蛋白表达趋势变化与TBI组相似，但表达量显著增加。
　　 4、海马区Beclin-1的Western blot检测结果:Sham+LY294002组与Sham组相比Beclin-1蛋白表达相应时间点无明显差异。TBI组与Sham组比较，伤后6h起Beclin-1逐渐增加，伤后24 h达峰值，后逐渐下降;Apocynin治疗组Beclin-1蛋白表达趋势与TBI组相似，但表达量显著减少，Apocynin+LY294002组与TBI组比较，相应时间点Beclin-1蛋白表达明显增加，组间差异均有有统计学意义(P＜0.05)。
　　 5、海马区LC3的Western blot检测结果:Sham+LY294002组与Sham组相比LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值无明显差异;与Sham组比较，TBI组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值于TBI后6h开始升高，于24 h达峰值，后表达逐渐下降;Apocynin组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值变化趋势与TBI组相似，但比值明显变小(P＜0.05);Apocynin+LY294002组与TBI组比较，各时间点LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显增加(P＜0.05)。
　　 6、LC3与海马CA1区NeuN荧光双标检测结果:激光共聚焦显微镜下可见LC3为TRITC标记的红色荧光，NeuN为FITC标记的绿色荧光。TBI组中可见海马CA1区神经元细胞胞浆中可见大量绿色和红色荧光重叠呈黄色聚集，证明神经元发生了自噬;Apocynin治疗组中红色荧光和绿色荧光重叠明显减少，神经元自噬程度减弱;Apocynin联合LY294002治疗组红色荧光和绿色荧光重叠明显增加，神经元自噬程度增强。
　　 7、P-Aktser-473与海马CA1区NeuN荧光双标检测结果:激光共聚焦显微镜下可见p-Aktser-473为TRITC标记的红色荧光，NeuN为FITC标记的绿色荧光。在TBI组中可见海马CA1区神经元细胞胞浆中可见大量绿色和红色荧光重叠呈黄色聚集;Apocynin治疗组中红色荧光和绿色荧光重叠明显增加，说明Apocynin通过抑制NADPH氧化酶而上调了海马CA1区神经元p-Aktset-473的表达。
　　 小结:大鼠发生弥漫性TBI后，NADPH氧化酶活性增加，抑制了氧化应激上调的Akt/mTOR信号通路相关蛋白的磷酸化水平;抑制TBI后NADPH氧化酶的激活可以上调Akt/mTOR信号通路的活性，减轻TBI后海马神经元自噬表达。
　　 结论:大鼠发生弥漫性中度TBI后，NADPH氧化酶参与了继发性脑损伤的发生，同时经介导Akt/mTOR信号转导通路活性参与对神经元自噬的调控;抑制TBI后NADPH氧化酶的激活，可以下调TBI后海马区神经元自噬的发生，减轻脑水肿，改善空间学习和记忆能力，具有神经保护作用。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 NADPH氧化酶活性和催化亚单位NOX2在大鼠弥漫性中度脑创伤后的表达变化及作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 大鼠弥漫性中度脑创伤后NADPH氧化酶对海马CA1区神经元自噬表达的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 大鼠弥漫性中度脑损伤后NADPH氧化酶对海马CA1区神经元自噬调节的分子机制研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

本课题创新点

参考文献

结论

综述 TBI后继发性脑损伤的研究进展

致谢

个人简历