未折叠蛋白反应对化疗药物诱导乳腺癌细胞凋亡的影响

摘要

目的：
　　1、探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)对人乳腺癌细胞凋亡的影响。
　　2、检测顺铂(cisplatin，CDDP)、阿霉素(adriamycin,ADR)对MDA-MB-231细胞及C3H小鼠移植性乳腺癌ERS的激活作用以及对Caspase-4/Caspase-12介导的细胞凋亡途径的影响。
　　3、探讨利用SiRNA干扰技术阻断UPR，对CDDP和ADR所致MDA-MB-231细胞凋亡的影响。
　　方法：
　　一、体外实验：
　　1、用衣霉素(Tunicamycin,TM)(3μmol/L)、CDDP(10 mg/L)、ADR(1mg/L)，处理MDA-MB-231细胞不同时间(0、6、12、24、36 h),Western blot检测葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein78，GRP78)的表达。
　　2、用CDDP、ADR处理MDA-MB-231细胞48 h后，用溴化丙啶(propidium iodide， PI)染色，流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率。
　　3、用CDDP、ADR处理MDA-MB-231细胞不同时间(0、6、12、24、36 h)，按Caspase-4活性检测试剂盒使用说明收集细胞并检测Caspase-4活性。
　　4、SiRNA干扰GRP78合成阻断UPR，再用CDDP、ADR处理MDA-MB-231细胞，检测细胞凋亡率和Caspase-4活性的改变。
　　二、体内实验
　　1、C3H小鼠自发性乳腺癌为瘤源制成细胞悬液，调细胞浓度为2×107/ml接种于无瘤C3H小鼠，随机分组。第9天起，每组分别给予生理盐水NS、ADR、CDDP腹腔注射，每3天给药一次，每3天测量肿瘤长短径1次，绘制肿瘤生长曲线，第21天处死小鼠，称量肿瘤重量，计算抑瘤率。
　　2、取肿瘤组织，提取蛋白，定量后Western blot检测GRP78及Caspase-12的表达。
　　3、肿瘤组织做常规石蜡包埋、切片并做HE染色，置显微镜下观察其病理表现。
　　4、肿瘤组织用免疫组化法检测处理组与非处理组中GRP78的表达。
　　结果：
　　一、体外试验
　　1、CDDP和ADR对MDA-MB-231细胞中GRP78表达和细胞凋亡的影响。
　　（1）CDDP和ADR上调GRP78的表达（P﹤0.01）。
　　（2）CDDP和ADR诱导MDA-MB-231细胞凋亡，凋亡率﹤30％。
　　（3）CDDP和ADR对Caspase-4的诱导呈先上升后下降的趋势，而对GRP78的诱导则呈线性上升趋势。
　　2、SiRNA干扰GRP78的合成对CDDP、ADR诱导MDA-MB-231细胞凋亡的影响。
　　（1）GRP78SiRNA转染，增加CDDP和ADR诱导的细胞凋亡率（P﹤0.01）。
　　（2）GRP78SiRNA转染增加Caspase-4的活性，取消Caspase-4活性的下降相，并使其呈现持续上升趋势。
　　二、体内试验
　　1、CDDP和ADR对C3H小鼠移植性乳腺癌细胞的生长具有明显的抑制作用，第21天测量移植肿瘤体积分别为：NS组1690.89±42.94 mm3，CDDP组549.78±20.87 mm3，ADR组750.18±64.64 mm3。与NS组比较，CDDP组和ADR组肿瘤体积明显减小，抑瘤率分别为60.48%、58.55%（P﹤0.01）。
　　2、HE染色组织病理学检查显示CDDP组、ADR组细胞大小不一，核质深染，可见点状坏死灶及大片的无结构红染坏死表现。
　　3、免疫组化结果显示，CDDP组和ADR组中GRP78表达呈现强阳性，NS组中表达较弱。
　　4、肿瘤组织提取蛋白Western blot检测GRP78表达，与NS组比较，CDDP组和ADR组GRP78表达明显增强（P﹤0.01）。检测Caspase-12的表达，与NS组比较，CDDP组和ADR组Caspase-12表达明显减弱（P﹤0.01）。
　　5、Caspase-12的Western blotting结果显示CDDP和ADR处理组动物肿组织的Caspase-12的表达明显降低（P﹤0.01）。
　　结论：
　　1、CDDP、ADR体外可诱导MDA-MB-231细胞，体内可诱导C3H小鼠移植性乳腺癌细胞产生ERS、UPR和GRP78的高表达。
　　2、干扰肿瘤细胞GRP78的表达可增强CDDP、ADR的抗肿瘤作用。二者联用可上调 Caspase活性，提升CDDP、ADR对肿瘤细胞凋亡的诱导作用。
　　3、GRP78不仅仅是乳腺癌细胞内质网应激的标志性产物，也是肿瘤细胞产生耐药的靶点之一，抑制GRP78的表达可以增加乳腺癌细胞对此类化疗药物的敏感性。

目录

中文摘要

英文摘要

引言

材 料 与 方 法

1．材料和仪器

1.1实验动物

1. 2 实验材料

1. 3实验仪器

2. 实验方法

2.1 细胞培养

2.2 溴化丙啶( propidium iodide, PI)染色检测细胞凋亡

2.3免疫印迹法（Western blotting）检测蛋白表达

2.4 SiRNA转染

2.5 Caspase-4活性的检测

2.6 移植肿瘤模型的建立[17]

2.7 实验分组

2.8 试验指标观察

3. 统计学处理

实 验 结 果

一、体外试验

（一）诱导ER应激，激活UPR对乳腺癌细胞GRP78表达和细胞凋亡的影响

（二）SiRNA转染对DNA损伤药物诱导的乳腺癌细胞凋亡的影响

二、体内试验

1、一般情况

2、CDDP、ADR对小鼠乳腺癌生长的抑制作用

3、CDDP、ADR对小鼠肿瘤组织学影响

4、CDDP、ADR对GRP78表达的影响

5、Caspase-12在小鼠肿瘤组织中的表达

讨论

结论

参考文献

致谢

附录A主要英文缩略词表

附录B已发表及待发表的文章

附录C 葡萄糖调节蛋白78与肿瘤细胞